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为什么 PCR 跑不出满意的结果?

来源:中国仪器批发网2019-11-18 15:25:01浏览:951
  PCR 是实验猿日常实验中最常用的技术,可如何运用好,操作好这门技术呢,可参考以下三大法宝。
  
  一、确保 RNA 样本合格
  
  常见的 RNA 提取方法有 TRIzol 法、吸附法,这两个方法各有所长,但都不能保证提取的 RNA 样本一定合格。
  

  因而,提取完成后应测定 RNA 的浓度及吸光度。通常,在 260,280,230 nm 处分别测定其吸光度(A260、A280、A230)并计算其比值(A260 /A280,A260 /A230)。

  
  那么,这几个数值及其比值分别有何意义?
  
  A260 为核酸的吸光度,A280 为蛋白质的吸光度,A230 为其他杂质(多糖等)的吸光度。纯 DNA 的 A260 /A280 为 1.8,纯 RNA 的 A260 /A280 为 2.0。
  
  如果 OD 比值不在范围内该如何解决呢?
  
  再次洗涤样本!
  
  75% 乙醇沉淀 RNA 后重新吸附、洗涤;若采用 TRIzol 法提取 RNA,可直接洗涤两次。洗涤后离心时可两次分别将 EP 管置于不同的方向,便于彻底洗涤 RNA 样本。通常洗涤两次后可使测得的 OD 值较为理想。
  
  二、 利用「RNAstructure」软件
  
  引物,是进行荧光定量实验的必备条件。其特异性的问题可通过「BLAST」搞定,让人比较头痛的是引物可以形成「发夹结构」或「二聚体」(即在<75℃ 时出现溶解曲线的峰),影响扩增效率,最终导致实验结果不可用。
  
  那么,这个问题能否解决呢?
  

  有!设计引物的时候用「RNAstructure」预测一下引物的二级结构即可。

  
  那么,这个软件要如何使用呢?
  

  1. 打开「RNAstructure」,单击左上角的「new sequence」按钮:

  

  2. 新建序列文件,会出现一个对话框,输入待检测的引物序列:

  

  3. 单击「Fold as DNA」,「save changes」,出现新的对话框后直接点击「Start」:

  

  4. 无需更改其他参数,再次点击「Draw structure」,即可得到目标序列的二级结构:

  
  若考察引物能否形成发夹结构,则直接检测 Forward 或 Reverse 引物即可。
  
  若考察引物能否形成二聚体,则把两条引物一起输入,视作一条序列进行检测即可。
  
  在得到二级结构图后,只要没有连续 4 个以上的配对即可;若一条引物长度为 20 bp,在 18~22 处有连续 5 个的碱基配对,则可「手动拆解配对」,即保证引物为两条链时的配对不多于 4 个即可。
  
  三、保证扩增效率符合要求
  
  有童鞋反映,两个同类基因测试同一批样本,理论上趋势应该一致,结果却是两种趋势,应该相信哪个呢?
  
  不知道各位看官有没有遇到类似的问题?这类问题该如何解决呢?
  
  先说说出现这类问题的原因吧:
  
  1. 扩增条件非最佳;
  
  2. 样本中含有抑制扩增的物质,如乙醇。
  
  一对引物有其特定的 Tm 值,但 Tm 值时未必是其最佳扩增温度。温度过高时,扩增效率过低,差异部分的目的基因不能被扩增,导致「假阴性」结果的出现。
  
  那么,如何确定扩增效率是否满足要求呢?
  
  通常,拿到新引物后应从 Tm- 5℃ 寻找其适宜的扩增温度,在某温度起为特异性扩增。
  
  然后,在特异性扩增的温度下检测扩增效率:将 cDNA 梯度稀释(一般为 2×),测试稀释后的样本 Ct 值差异是否为 1 左右。
  
  若差值为 1,则扩增效率良好,可进行正式实验。
  

  若在特异性扩增的温度范围内不能使 Ct 值差异为 1,则需考虑重新设计引物。

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