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磁珠法提取核酸过程中的常见误区

来源:中国仪器批发网2019-11-04 09:03:30浏览:874

  核酸分离是目前分子生物学中日益重要的一项技术,在现代技术得到应用之前,核酸分离是一个基于多步提取以及离心的耗时耗力的过程,且常常由于受到分离产物产量小、纯度低的限制,不适合自动化以及规模化。在过去几年里,有着特定功能的磁性微珠被开发出来,配合适当的缓冲液系统,可使其从粗细胞提取物中直接快速有效地纯化出核酸,避免了离心步骤。此外,新方法提供了整个过程以及从更大的样本容量中提取核酸的简单自动化。


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  磁珠法提取核酸一般包括裂解、结合、洗涤、洗脱四个主要步骤。那么吸附核酸的磁珠的功能是怎样的。它为什么能够吸附核酸呢?

  
  图1 磁珠技术纯化核酸原理图
  核酸提取系列微球均为硅羟基磁珠,该系列磁珠主要以超顺磁铁Fe3O4为内核,外表面修饰有SiO2层。并进行特殊的非特异性吸附处理,通过控制微球粒径的大小,表面SiO2的厚度,以及硅羟基(-SiOH)密度,获得拥有不同核酸富集性能的系列纳米材料,可以针对不同类型目标核酸选择最合适的规格进行核酸提取、纯化实验。
  
  磁珠法核酸提取过程中,有时候会出现核酸浓度偏低的情况,实验人员可能会怀疑,是不是我样品加的不够多?是不是我的磁珠加的不够多?但有时候恰恰可能是有些成分加的过多。
  
  磁珠法提取核酸过程中的常见误区
  
  01.样本量取的越多,提取效果越好
  
  一般在样本不够新鲜或者样本中核酸含量本身就不多的情况下,核酸提取效果不好,这时往往会采用多取样本量来增加核酸提取量。但简单的增加样本量,往往会引入更多的杂质,超出裂解液的裂解能力,也会使得提取效率降低。所以并不推荐通过简单的增加样本取样量的方式来达到增加提取量的目的。如果确实是由于样本量不足而引起的提取量过低,建议在前处理先经过富集或者浓缩步骤再开始提取。或者增加裂解的完全性,使更多的核酸暴露出来也是一种解决方法。
  
  02.试剂使用的越多,提取效果越好
  
  裂解效果不好?多加点裂解液。洗涤效果不好?多加点洗涤液。这是大家在使用试剂盒时的惯性思维。但是对于磁珠法而言,每增加一部分液体体积,就减少了更多的磁珠碰撞几率,而降低磁珠碰撞几率,会导致吸附率的大幅度下降。所以很多时候,虽然增加裂解液和洗涤液确实能够起到增强裂解和增强洗涤的作用,但磁珠法提取的核心是磁珠吸附核酸的效率,无法保证磁珠碰撞效率是不能保证核酸提取效率的,所以单纯增加试剂使用量改善提取效果并不一定完全有效。
  
  03.磁珠使用的越多,提取效果越好
  
  有很多实验者喜欢在提取效果不佳的时候,增加磁珠的用量,认为磁珠多加一点,就能吸上更多的核酸,不得不说这种想法是不可取的。磁珠的主要特点是既可以分散于液体中,也可以在外加磁场作用下以固态方式和液相分离,任何试剂体系,磁珠和液体的比例都应该是有一定阈值的,超过一定的比例,过多的磁珠将因为无法均匀分散于液体中,而丧失其分散的特性,也使得洗涤过程中无法充分增加核酸磁珠和液体接触的效率。而过量的磁珠也会吸附更多的杂质,对于除杂的效果影响非常大。甚至有些时候,过多的磁珠会吸附蛋白酶、溶菌酶等在液体体系中起主要作用的功能成分,导致整个试剂盒效率低下。有很多时候,在提取效果不佳的时候,减少磁珠使用量,反而是提升提取效果的最优途径。
  
  04.洗涤次数越多,提取效果越好
  
  提取得到的核酸杂质过多时,实验者会考虑多进行几次洗涤,以得到更为纯净的核酸。增加洗涤次数确实有利于提纯核酸,但考虑到每次洗涤都会损失一定量的核酸,且增加了核酸断裂水解的可能性,所以一般来说洗涤次数控制在2~4次为宜。
  
  05.和某种试剂盒对比效果不好,就是磁珠不好
  

  很多实验人员在筛选磁珠过程中都是在已经成熟试剂体系下,简单地等量替换磁珠,用于比较磁珠效果。这样就会很容易得出某种磁珠效果不好的结论,但实际上,由于不同磁珠适合的体系和用量是不同的,往往需要调整过后才能获得更好的提取效果。

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