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在核酸、蛋白浓度检测过程中,230nm、260nm、280nm代表什么?

来源:中国仪器批发网2019-10-17 16:05:23浏览:4288

在核酸、蛋白浓度检测过程中,230nm、260nm、280nm这几个数值经常会出现,那这几个数值代表什么?他们之间的最优关系又是什么呢?



230nm、260nm、280nm

230nm:碳水化合物最高吸收峰的吸收波长,与A260的比值可进行核酸样品纯度评估。A230产生负值可能是由于在低核酸浓度的样液中存在一些干扰成分。

260nm:核酸最高吸收峰的吸收波长,其吸收紫外光的性质是嘌呤环和嘧啶环的共轭双键系统所具有的,所以嘌呤和嘧啶以及一切含有它们的物质,不论是核苷、核苷酸或核酸在260nm处都会一个最高吸收峰。

280nm:蛋白质由于含有芳香氨基酸,因此也能吸收紫外光,通常蛋白质的吸收高峰在280nm波长处。其与260nm处的吸光度比值,经常被用于判断核酸样品的纯度。


除了这三个常见的波长外,在核酸检测过程中340nm往往会被用来检测样品缓冲液的浊度和其他干扰因子。该值应该接近0.0,如果不是,表明溶液中有悬浮物。


图1. 核酸、蛋白质吸光度谱


260/230、260/280

纯度好的DNA或RNA,在pH7-8.5下:

A260 / A280比值应大于1.8(DNA)或者2.0(RNA)。

如果比值低于1.8 或者2.0,表示存在蛋白质或者酚类物质的影响。

较纯净的核酸A260/A230的比值一般在1.8-2.2之间。

比值降低往往是样品中存在一些污染物,如碳水化合物、盐(胍盐)等。

但实际样品情况往往要相对复杂,如《分子克隆实验指南》(第三版)所述,当 0.5%BSA蛋白质污染时,A260和A280的数值都下降,其结果是260/280的比值略微下降。但同时,蛋白残留会导致A230的数值明显上升,进而显著影响260/230的比值。也就是说,如果样品的260/280比值略低于标准值,但260 /230下降明显,那么就应该考虑污染原因是蛋白残留,而不是胍盐残留。

酚的最大吸收峰在270nm。酚的残留会增加A230、A260和A280的数值,同时酚的吸收峰与核酸的吸收峰合并后,最大吸收峰会出现在270nm附近。因此当样品最大吸收峰会出现在270nm附近,且260/280=1~1.5, 260/230=1~1.5,那么污染原因就应该考虑是酚残留。

胍盐会在小于230nm处产生大的吸收峰,进而显著影响260/230比值,但胍盐残留不会影响A260、A280的数值,以及260/280的比值。也就是说,如果核酸样品的260/280符合要求,但260/230<1,那么污染原因就应该考虑是胍盐残留。

图2. 纯DNA和受污染DNA的吸光度谱


其他影响因素


样品缓冲液pH值、离子浓度等


核酸的吸光值受pH值和缓冲液离子浓度影响,只有在一定的pH值和低离子浓度的条件下(如TE),才能得到精确的检测结果。水由于pH值不稳定,可能会导致检测误差。此外一些缓冲液在紫外范围内存在自身吸收,为了确保准确测量,请使用与悬浮或洗脱样品时相同的缓冲液。


样品浓度

由于样品中不可避免存在一些细小的颗粒,这些小颗粒的存在干扰测试效果,为了减少颗粒对检测结果的影响,要求样品吸光值至少大于0.1A,以减小颗粒的干扰。


操作因素

样品混合要充分,否则容易出现样品浓度重复检测波动大;混合液不能存在气泡,空白页无悬浮液,否则读数漂移剧烈;

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