miRNA检测：技术路线怎么选？

在分子诊断与生命科学研究中，微小RNA（miRNA）作为关键的调控分子，其精准定量一直是技术难点。由于其序列短（通常仅18-25 nt）、表达量低、同源家族序列相似度高，传统的荧光定量PCR（qPCR）技术直接检测难度较大。

目前，主流方法主要通过 “先延长，再检测” 的思路来解决长度问题，主要分为两大技术路线：

一、两大主流技术：加尾法 vs. 茎环法

1. 加尾法

• 原理：在 miRNA 3' 端添加 poly(A) 尾，再通过通用引物进行反转录和扩增。

• 优点：流程相对简单，适用于高通量检测，兼容多数qPCR体系。

• 缺点：加尾效率可能受RNA结构影响，对部分 miRNA 可能存在偏好性。

2. 茎环法

• 原理：设计茎环结构的反转录引物，其环部与 miRNA 互补，实现特异性延伸。

• 优点：反转录特异性高，尤其适用于区分相似序列的 miRNA。

• 缺点：引物设计复杂，成本较高，多重检测时易受结构干扰。

小结：两种方法本质都是“将 miRNA 延长为可扩增的 cDNA”，后续仍多依赖 qPCR 进行定量。选择时需权衡 特异性、通量、成本与实验目标。

miRNA是一类长约18-25个核苷酸的内源性非编码RNA分子，是基因调控网络中的重要组成部分。目前miRNA在肿瘤，神经性退化，心脑血管疾病等都有比较大的相关性，可以作为多种疾病的标志物，miRNA也逐渐成为检测医学中的明星分子。

加尾法：

这种方法非常好理解，就是通过加尾酶，在3'短连接上一段poly A的序列，增长miRNA的长度。然后的检测方法就和其它RNA检测没有差别了。

加尾法的miRNA检测流程图

茎环法：

茎环法是设计一种茎环结构的反转录引物，有点像把miRNA作为引物的概念，在反转录过程中，利用miRNA和反转录引物，在反转录的cDNA延伸出了miRNA的互补序列。

茎环法示意图

二、检测方法再分层：染料法 vs. 探针法

在“延长”之后，实际检测环节还需选择信号生成方式：

• 染料法：成本低、操作简便，但特异性较弱，难以进行多重检测。

• 探针法：特异性强、可实现多靶标同时检测，但设计复杂、价格较高。

对于 miRNA 表达谱分析或多指标联检，探针法结合多色荧光通道已成为主流选择。

三、数字PCR：miRNA 定量的“未来利器”？

尽管 qPCR 仍是当前主流，但 数字PCR（dPCR） 正在 miRNA 检测中展现出独特优势：

• 绝对定量：无需标准曲线，直接输出拷贝数，提升数据可比性。

• 高灵敏度与准确性：尤其适用于低丰度 miRNA 或外泌体样本检测。

• 适合复杂样本：对抑制剂耐受度更高，减少样本纯化要求。

目前，加尾法与茎环法均可与 dPCR 平台兼容。值得注意的是，部分国产平台如 小海龟科技数字PCR 也已支持 EvaGreen 染料法检测，为科研用户提供了低成本、高灵活性的选择。

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