如何精准定量乳制品中活性益生菌

精准定量乳制品中的活性益生菌是一个行业难题，这正是数字PCR（dPCR）技术相比其他方法展现其巨大优势的核心场景。

数字PCR通过结合前处理技术（如PMA/GEMAxx染料） 与其固有的绝对定量能力，能够特异性地检测并精准计数仅存在于活菌中的目标DNA，从而实现对活性益生菌的超高精度定量。

一、关键挑战：区分“死”与“活”

无论是传统PCR还是qPCR，它们检测的都是DNA本身，无法区分DNA是来自活菌、死菌还是裂解的细胞碎片。乳制品在加工、储存和运输过程中，必然会有部分益生菌死亡，但这些死菌的DNA依然存在，会导致基于DNA的检测方法严重高估活菌的数量。

二、数字PCR的解决方案：强强联合

dPCR本身并不能区分DNA的来源，但它可以与一种名为核酸染料预处理的技术完美结合，从而特异性靶向活菌。

核心技术：PMA/GEMAxx 染料（活菌染料）

原理：

1.染料特性：PMAxx（叠氮溴化丙锭）是一种膜不可渗透的DNA染料。它本身不具有荧光信号，但能够选择性地穿透受损的细胞膜（即死菌）。

2.选择性结合：当将PMAxx染料添加到乳制品样品中时，它会进入死菌内部，并与其DNA紧密结合。

3.光交联：在强光照射下，染料会与DNA发生永久性共价交联。

4.抑制PCR：这种交联的DNA在后续的DNA提取和PCR扩增过程中会被强烈抑制，无法被扩增检测。

结果：

只有细胞膜完整的活菌，其DNA不会被染料结合，从而能够被完整地提取并进行正常的PCR扩增。

数字PCR的角色：精准计数

前处理步骤确保了只有活菌的DNA被检测到。接下来，dPCR发挥其绝对定量的优势：

1.DNA提取：从经过PMAxx处理的酸奶样品中提取总DNA。

2.分区：将PCR反应体系分割成数万个纳米级的微滴。每个微滴包含“0”或“1”或更多个目标DNA分子（这里是活菌的特异性基因片段，如16S rRNA基因）。

3.PCR扩增：使用针对特定益生菌（如Lactobacillus acidophilus NCFM® 或 Bifidobacterium animalis BB-12®）设计的特异性引物和探针进行扩增。含有目标DNA的微滴会产生荧光信号（阳性），不含的则不产生（阴性）。

4.计数与计算： 通过读取阳性微滴的比例，利用泊松分布统计模型，直接计算出原始样品中活性目标益生菌的绝对浓度（拷贝数/μL或CFU/g），无需依赖标准曲线。

三、技术流程总结

整个精准定量活性益生菌的流程可以概括为：

酸奶样品→ PMAxx染料处理 + 光交联 → DNA提取 → 数字PCR定量检测→ 报告活性益生菌浓度

四、相比其他方法的巨大优势

优势体现：

1.特异性活菌检测：PMAxx预处理确保了检测目标益生菌是活菌。

2.绝对定量，无需标准曲线：避免了制作标准品带来的误差和不确定性，结果更可靠。

3.极高的灵敏度和精确度：即使样品中活性益生菌浓度很低，也能被有效检测和计数。

4.强大的抗干扰能力：酸奶中的蛋白质、脂肪、糖等PCR抑制物在样品被分割到数万个微滴后会被极大稀释，从而显著降低其对PCR扩增效率的抑制，使结果更准确。这是dPCR相对于qPCR的一个关键优势。

五、结论

数字PCR技术，通过与PMAxx等活菌染料联用，为解决长期困扰食品行业的活性益生菌精准定量难题提供了目前最先进、最可靠的分子检测方案。它不仅能够特异性地“忽略”死菌的干扰，还能以极高的精度直接报告出活性目标菌的数量，为乳制品的质量控制、货架期研究、功效宣称验证以及新产品研发提供了强大的数据支撑。

小海龟超多重数字PCR解决方案：13066324063