核酸实验室污染源、防污染措施及权威处理方案

　　近期随着德尔塔毒株疫情的再起，高强度的核酸检测任务已然成为了我们检验人的工作常态，核酸检测实验室污染问题也是大家近期比较关心的话题。
　　
　　
　　01　▶PCR 实验室的潜在污染来源◀
　　
　　①临床标本中存在的大量待测微生物或待测靶核酸
　　
　　②科研中得到的质粒克隆
　　
　　③以前分析研究的特定微生物或靶核酸
　　
　　④大量存在于实验环境中的特定微生物或靶核酸
　　
　　⑤以前扩增产物的残留污染,这也是 PCR 实验室最容易产生的将造成假阳性的“污染”。 
　　
　　PCR扩增可以引起实验室中扩增产物的累积,通常一次典型的PCR 扩增可以产生109拷贝的靶序列,如果气溶胶化,甚至最小的气溶胶都会含有106拷贝的扩增产物。如果不加以控制,在短期内累积的气溶胶化的扩增产物即会污染实验室中的试剂、仪器设备和通风系统,从而造成严重的实验室“污染”,出现大量的假阳性结果。
　　
　　02　▶PCR 实验室的防污染措施◀
　　
　　进行PCR操作时，操作人员应该严格遵守一些操作规程，最大程度地降低可能出现的PCR污染或杜绝污染的出现。
　　
　　(一) 划分操作区
　　
　　目前，普通PCR尚不能做到单人单管，实现完全闭管操作，但无论是否能够达到单人单管，均要求实验操作在三个不同的区域内进行，PCR的前处理和后处理要在不同的隔离区内进行：
　　
　　1.  试剂准备区。
　　
　　2．标本制备区。
　　
　　3.  PCR扩增区及分析区。
　　
　　各工作区要有一定的隔离，操作器材专用，要有一定的方向性。如：试剂准备→标准制备→PCR扩增区及分析区。
　　
　　切记：任何一间的产物及器材不要拿到其他两个工作区。
　　
　　(二) 分装试剂
　　
　　PCR扩增所需要的试剂均应在生物安全柜、装有紫外灯的超净工作台或负压工作台配制和分装。所有的加样器和吸头需固定放于其中，不能用来吸取扩增后的DNA和其他来源的DNA：
　　
　　1．PCR用水应为高压的双蒸水；
　　
　　2．引物和dNTP用高压的双蒸水在无PCR扩增产物区配制；
　　
　　3．引物和dNTP应分装储存，分装时应标明时间，以备发生污染时查找原因。
　　
　　(三) 实验室的严格分区及工作程序的严格遵守
　　
　　试剂准备区、样本准备区、扩增区、检测区等必须备有其各自必需的仪器设备、工作服、手套、加样器和通风系统。在每个区使用的试剂和废物,必须直接在其各自的区域内分装或包装。操作人员必须注意防止通过他们的头发、眼镜、首饰和衣服将扩增产物从污染区携带至清洁区的可能性。
　　
　　(四)化学方法
　　
　　实验台面可使用10%的次氯酸钠(漂白剂)清洗,然后再用70%乙醇或清水洗去次氯酸钠。次氯酸钠具有氧化损伤核酸的作用,从而使可能的留在实验台面的扩增产物被破坏掉。要注意的是,次氯酸钠不能区分提取的目的 DNA 和 PCR 扩增产物,用次氯酸钠处理的样本不能用于核酸扩增检测。在实际工作中,有些物品比如放置扩增反应管的盘必须从污染区转回到清洁区时,在转回之前,应将其置于2%~10%的次氯酸钠溶液中过夜,并充分冲洗。
　　
　　(五)扩增产物的修饰
　　
　　如对以前扩增产物进行适当修饰,应可以消除其污染后面新的扩增检测,但为保证不影响靶核酸的扩增检测,扩增产物修饰方法必须遵循两个基本原则:
　　
　　一是扩增产物被修饰后,应可以与随后打增的靶序列区分
　　
　　二是修饰不能干扰正常的扩增检测。
　　
　　(六) 实验操作注意事项
　　
　　尽管扩增序列的残留污染大部分是假阳性反应的原因，样品间的交叉污染也是原因之一。因此，不仅要在进行扩增反应是谨慎认真，在样品的收集、抽提和扩增的所有环节都应该注意：
　　
　　1.  戴一次性手套，若不小心溅上反应液，立即更换手套；
　　
　　2.  使用一次性吸头，严禁与PCR产物分析室的吸头混用，吸头不要长时间暴露于空气中，避免气溶胶的污染；
　　
　　3.  避免反应液飞溅，打开反应管时为避免此种情况，开盖前稍离心收集液体于管底。若不小心溅到手套或桌面上，应立刻更换手套并用稀酸擦拭桌面；
　　
　　4.  操作多份样品时，制备反应混合液，先将dNTP、缓冲液、引物和酶混合好，然后分装，这样即可以减少操作，避免污染，又可以增加反应的精确度；
　　
　　5.  最后加入反应模板，加入后盖紧反应管；
　　
　　6.  操作时设立阴阳性对照和空白对照，即可验证PCR反应的可靠性，又可以协助判断扩增系统的可信性；
　　
　　7.  尽可能用可替换或可高压处理的加样器，由于加样器最容易受产物气溶胶或标本DNA的污染，最好使用可替换或高压处理的加样器。如没有这种特殊的加样器，至少PCR操作过程中加样器应该专用，不能交叉使用，尤其是PCR产物分析所用加样器不能拿到其它两个区；
　　
　　8.  重复实验，验证结果，慎下结论。
　　
　　03　▶实验室污染的监测◀
　　
　　一个好的实验室，要时刻注意污染的监测，考虑有无污染是什么原因造成的污染，以便采取措施，防止和消除污染。
　　
　　对照试验
　　
　　1、阳性对照：在建立PCR反应实验室及一般的检验单位都应设有PCR阳性对照，它是PCR 反应是否成功、产物条带位置及大小是否合乎理论要求的一个重要的参考标志。阳性  对照要选择扩增度中等、重复性好，经各种鉴定是该产物的标本，如以重组质粒为阳性对照，其含量宜低不宜高(100个拷贝以下)。但阳性对照尤其是重组质粒及高浓度阳性标本，其对检测或扩增样品污染的可能性很大.因而当某一PCR试剂经自己使用稳  定，检验人员心中有数时，在以后的实验中可免设阳性对照。
　　
　　2、阴性对照：每次PCR实验务必做阴性对照。它包括①标本对照：被检的标本是血清就用鉴定后的正常血清作对照；被检的标本是组织细胞就用相应的组织细胞作对照。②试剂对照：在PCR试剂中不加模板DNA或RNA，进行PCR扩增，以监测试剂是否污染。
　　
　　3、重复性试验
　　
　　4、选择不同区域的引物进行PCR扩增
　　
　　04　▶实验室污染的消除◀
　　
　　实验室一旦发生污染，检测工作应立即停止，直到确认消除污染后才能重新开始检测。首先，要查找污染源和明确污染范围。然后，根据污染源和污染范围采取有效的去污染措施，结合各种不同方法以达到最佳效果。
　　
　　1.标本污染生物安全柜的操作台造成局限污染时：
　　
　　立即用吸水纸覆盖，并使用0.55%含氯消毒剂进行喷洒消毒。消毒液需要现用现配，24小时内使用。
　　
　　2.标本倾覆造成实验室污染时：
　　
　　保持实验室空间密闭，避免污染物扩散。立即使用润湿有0.55%含氯消毒剂的毛巾覆盖污染区。必要时（如大量溢撒时）可用过氧乙酸加热熏蒸实验室，剂量为2g/m³，熏蒸过夜；或20g/L过氧乙酸消毒液用气溶胶喷雾器喷雾，用量8ml/m³，作用1-2小时；必要时或用高锰酸钾-甲醛熏蒸：高锰酸钾8g/m³，放入耐热耐腐蚀容器（陶罐或玻璃容器），后加入甲醛（40%）10ml/m³，熏蒸4小时以上。熏蒸时室内湿度60%-80%。
　　
　　3.清理污染物时：
　　
　　严格遵循活病毒生物安全操作要求，采用压力蒸汽灭菌处理，并进行实验室换气等，防止次生危害。
　　
　　05  ▶新冠病毒核酸检测常见问题◀
　　
　　1、新冠试剂出现翘尾，怎么处理？
　　
　　答：如果是个别单一通道翘尾，不管是FAM还是VIC通道，首先按照要求复查，复查建议重新采样，如果不方便重新采样建议对原有样本进行重新提取核酸验证，如果复查阴性判读阴性，如果复查还是同一通道翘尾，就要对结果仔细审核，一是要排除实验室污染，二是要对病人信息了解清楚，从临床症状及接触史排查，如果没法确认，建议必须重新采样复查，如有必要可以采用另一家试剂来验证。如果出现大量的弱阳性扩增翘尾，首要原因是考虑实验室污染，可以通过做环境样本和阴性对照做验证排除。
　　
　　2、N基因和1ab基因是新冠病毒的特有基因吗，灵敏度哪个更高？是否会和其他冠状病毒片段重叠？
　　
　　答：N基因跟1ab都是特异的，不会跟其他呼吸道病原体交叉反应。设计时候，两个基因的序列不一样，导致灵敏度不一样，N基因的灵敏度比1ab灵敏度高。
　　
　　3、新冠检测结果和临床诊断不符合，怎么解读？
　　
　　答：新冠病毒由于是RNA病毒，容易降解，另外检测结果也和取样，核酸提取以及样本本身的核酸浓度有关，需要逐一分析，同时可以结合临床症状判读。
　　
　　4、采用生理盐水做阴性对照，内标也会增长，怎么解释？
　　
　　答：因为试剂采用的是内源性内标，内源性内标是用人源基因标记，此基因存在于人的表皮细胞内，操作过程中就可能会出现人源性的污染，另外环境污染也有可能导致内标增长，这也是前面提到的建议做环境样本质控。
　　
　　5、新冠样本内标不出如何处理？
　　
　　答：如果新冠样本内标不出，该样本必须复查，可重新混匀该样本提取核酸，如果重新提取该样本内标还是不出，在排除提取问题的情况下，说明采样不合格，要通知临床重新采样复查。
　　
　　6、采集环境样本检测新冠状病毒，为啥大部分样本内标不出，偶尔个别样本检测出内标？
　　
　　答：因为新冠试剂检测的是人内源性内标，环境样本一般不含有人源细胞，所以检测不出内标；偶尔检出内标，可能该环境样本上有人源性细胞粘附，故而检出内标。
　　
　　最后是两条有用的小诀窍：
　　
　　● 面对多份样品，制备反应混合液时，先将 dNTP、缓冲液、引物和酶混合好，然后用分液功能进行分装。
　　
　　● 在加入模板时，按照“阴性对照-待测样品-阳性对照”的加样顺序，操作上应遵循“开管盖-加模板-盖管盖”的原则。