实时荧光定量PCR技术实验步骤

实验方法原理 实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最-后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
实验材料
细胞样品
试剂、试剂盒
RNA提取试剂盒 荧光定量PCR Mix TRIZOL dNTP 氯-仿 逆转录酶MMLV 异丙醇 Taq酶 DEPC水 ddH2O TE MgCl2 琼脂糖 溴化乙锭 MOPS 甲醛 乙酸钠 EDTA EB 溴酚兰
仪器、耗材
离心管 离心机 风光光度计 电泳槽 凝胶板 Realtime PCR仪

实验步骤
一、 样品RNA的抽提
1.  取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其完全溶解。
2.  两相分离 每1 ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2 ml的氯-仿，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12 000 rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯-仿相，中间层以及无色水相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。
3.  RNA沉淀 将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃下12 000 rpm 离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。
4.  RNA清洗 移去上清液，每1 mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1 ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O配制），清洗RNA沉淀。混匀后，4℃下7 000 rpm离心5分钟。
5.  RNA干燥 小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。

6.  溶解RNA沉淀 溶解RNA时，先加入无RNA酶的水4 0ul用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得的RNA溶液保存于-80℃待用。

二、 RNA质量检测
1.  紫外吸收法测定
先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。然后取少量RNA溶液用TE稀释（1:100）后，读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值，测定RNA溶液 浓度和纯度。
 （1）浓度测定
A260下读值为1表示40 ug RNA/ml。样品RNA浓度(μg/ml)计算公式为：A260 x 稀释倍数 x 40 ug/ml。具体计算如下：
RNA溶于40 ul DEPC水中，取5 ul，1:100稀释至495 ul的TE中，测得A260 = 0.21
RNA 浓度= 0.21 x 100 x 40 ug/ml = 840 ug/ml 或 0.84 ug/ul
取5 ul用来测量以后，剩余样品RNA为35 ul，剩余RNA总量为：
35 ul x 0.84 ug/ul = 29.4 ug
（2）纯度检测

RNA溶液的A260/A280的比值即为RNA纯度，比值范围1.8到2.1。

2.  变性琼脂糖凝胶电泳测定
（1）制胶
1 g琼脂糖溶于72 ml水中，冷却至60℃，10 ml的10 x MOPS电泳缓冲液和18 ml的37% 甲醛溶液(12.3 M)。
10x MOPS电泳缓冲液
浓度  成分
0.4 M  MOPS，pH 7.0
0.1 M  乙酸钠
0.01 M  EDTA
灌制凝胶板，预留加样孔至少可以加入25 μl溶液。胶凝后取下梳子，将凝胶板放入电泳槽内，加足量的1xMOPS电泳缓冲液至覆盖胶面几个毫米。
（2）准备RNA样品
取3 ugRNA，加3倍体积的甲醛上样染液，加EB于甲醛上样染液中至终浓度为10 ug/ml。加热至70℃孵育15分钟使样品变性。
（3）电泳
上样前凝胶须预电泳5 min，随后将样品加入上样孔。5-6 V/cm电压下2 h，电泳至溴酚兰指示剂进胶至少2-3 cm。
（4）紫外透射光下观察并拍照

28S和18S核糖体RNA的带非常亮而浓（其大小决定于用于抽提RNA的物种类型），上面一条带的密度大约是下面一条带的2倍。还有可能观察到一个geng小稍微扩散的带，它由低分子量的RNA（tRNA和5S核糖体RNA）组成。在18S和28S核糖体带之间可以看到一片弥散的EB染色物质，可能是由mRNA和其它异型RNA组成。RNA制备过程中如果出现DNA污染，将会在28S核糖体RNA带的上面出现，即geng高分子量的弥散迁移物质或者带，RNA的降解表现为核糖体RNA带的弥散。用数码照相机拍下电泳结果。

三、样品cDNA合成
1.  反应体系
序号          反应物           剂量
1          逆转录buffer       2 ul
2         上游引物              0.2 ul
3         下游引物              0.2 ul
4          dNTP                   0.1 ul
5       逆转录酶MMLV     0.5 ul
6         DEPC水              5 ul
7          RNA模版            2 ul
8           总体积               10 ul
轻弹管底将溶液混合，6 000 rpm短暂离心。
2.  混合液在加入逆转录酶MMLV 之前先70℃干浴3分钟，取出后立即冰水浴至管内外温度一致，然后加逆转录酶0.5 ul，37℃水浴60分钟。

3.  取出后立即95℃干浴3分钟，得到逆转录终溶液即为cDNA溶液，保存于-80℃待用。

四、 梯度稀释的标准品及待测样品的管家基因（β-actin）实时定量PCR
1.  β-actin阳性模板的标准梯度制备 阳性模板的浓度为1011，反应前取3 μl按10倍稀释（加水27 ul并充分混匀）为1010，依次稀释至109、108、107、106、105、104，以备用。
2.  反应体系如下：
标准品反应体系
序号           反应物                           剂量
1       SYBR Green 1 染料             10 ul
2       阳性模板上游引物F              0.5 ul
3      阳性模板下游引物R              0.5 ul
4                 dNTP                            0.5 ul
5                 Taq酶                           1 ul
6           阳性模板DNA                    5 ul
7              ddH2O                            32.5 ul
8               总体积                            50 ul
轻弹管底将溶液混合，6 000 rpm短暂离心。
3.  管家基因反应体系：
序号            反应物                                剂量
1      SYBR Green 1 染料                   10 ul
2      内参照上游引物F                         0.5 ul
3     内参照下游引物R                         0.5 ul
4               dNTP                                    0.5 ul
5               Taq酶                                   1 ul
6      待测样品cDNA                             5 ul
7              ddH2O                                  32.5 ul
8             总体积                                    50 ul
轻弹管底将溶液混合， 6000 rpm短暂离心。

3.  制备好的阳性标准品和检测样本同时上机，反应条件为：93℃?2分钟，然后93℃ 1分钟，55℃ 2分钟，共40个循环。

五、 制备用于绘制梯度稀释标准曲线的DNA模板
1.  针对每一需要测量的基因，选择一确定表达该基因的cDNA模板进行PCR反应。
2.  反应体系
序号                     反应物                        剂量
1                     10× PCR缓冲液            2.5 ul
2                           MgCl2 溶液              1.5 ul
3                           上游引物F                 0.5 ul
4                           下游引物R                0.5 ul
5                            dNTP混合液            3 ul
6                            Taq聚合酶               1 ul
7                             cDNA                       1 ul
8                    加水至总体积为               25 ul
轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。
35个PCR循环（94℃1分钟；55℃1分钟；72℃1分钟）； 72?C延伸5分钟。
（3）PCR产物与 DNA Ladder在2％琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，检测PCR产物是否为单一特异性扩增条带。

（4）将PCR产物进行10倍梯度稀释: 将PCR产物进行10倍梯度稀释: 设定PCR产物浓度为1×1010，依次稀释至109、108、107、106、105、104几个浓度梯度。

六、 待测样品的待测基因实时定量PCR
1.  所有cDNA样品分别配置实时定量 PCR反应体系。
2.  体系配置如下：
序号             反应物                                剂量
1            SYBR Green 1 染料               10 ul
2                上游引物                               1 ul
3                下游引物                               1 ul
4                  dNTP                                   1 ul
5              Taq聚合酶                               2 ul
6             待测样品cDNA                        5 ul
7                   ddH2O                              30 ul
8                   总体积                               50 ul
轻弹管底将溶液混合，6 000 rpm短暂离心。

（3）将配制好的PCR反应溶液置于Realtime PCR仪上进行PCR扩增反应。反应条件为：93℃ 2分钟预变性，然后按93℃ 1分钟，55℃1分钟，72℃1分钟，共40做个循环，最后72℃7分钟延伸。

七、 实时定量PCR使用引物列表
引物设计软件：Primer Premier 5.0，并遵循以下原则：引物与模板的序列紧密互补；引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构；引物不在模板的非目的位点引发DNA 聚合反应(即错配)。
八、电泳

各样品的目的基因和管家基因分别进行Realtime PCR反应。PCR产物与 DNA Ladder在2％琼脂糖凝胶电泳，GoldView染色，检测PCR产物是否为单一特异性扩增条带。

注意事项
1.荧光阈值：在荧光扩增曲线指数增长长期设定一个荧光强度标准（即PCR扩增产物量标准）。荧光阈值可设定在指数扩增阶段任意位置上，但实际应用要结合扩增效率，线性回归系数等参数来综合考虑。
2.Ct值：在PCR扩增过程中，扩增产物（荧光信号）到达阈值时所经过的扩增循环次数。Ct值具有极-好的重复性。
其他
实时荧光定量PCR技术有效地解决了传统定量只能终点检测的局限，实现了每一轮循环均检测一次荧光信号的强度，并记录在电脑软件之中，通过对每个样品Ct值的计算，根据标准曲线获得定量结果。因此，实时荧光定量PCR无需内标是建立在两个基础之上的：
1）Ct值的重现性PCR循环在到达Ct值所在的循环数时，刚刚进入真正的指数扩增期（对数期），此时微小误差尚未放大，因此Ct值的重现性极-好，即同一模板不同时间扩增或同一时间不同管内扩增，得到的Ct值是恒定的。
2）Ct值与起始模板的线性关系由于Ct值与起始模板的对数存在线性关系，可利用标准曲线对未知样品进行定量测定，因此，实时荧光定量PCR是一种采用外标准曲线定量的方法。
外标准曲线的定量方法相比内标法是一种准确的、值得信赖的科学方法。利用外标准曲线的实时荧光定量PCR是迄今为止定量最准确，重现性最-好的定量方法，已得到全世界的公认，广泛用于基因表达研究、转基因研究，药物疗效考核、病原体检测等诸多领域。