实验室灭菌消毒的选择

灭菌（Sterilization）是指用物理或化学的方法杀灭全部微生物，包括致病和非致病微生物以及芽孢，使之达到无菌保障水平。经过灭菌处理后，未被污染的物品，称无菌物品。经过灭菌处理后，未被污染的区域，称为无菌区域。 

《医院感染管理办法（卫生部令第48号）》（2006）第七章附则第三十六条本办法中下列用语的含义：（五）灭菌：杀灭或者消除传播媒介上的一切微生物，包括致病微生物和非致病微生物，也包括细菌芽胞和真菌孢子。同时，灭菌可以看成是一个过程，所以在《GBT19974-2005 医疗保健产品灭菌灭菌因子的特性及医疗器械灭菌工艺的设定、确认和常规控制的通用要求》中有如下定义：3.25 灭菌 sterilization 用来使产品无存活微生物的过程

微生物

微生物对灭菌剂的抵抗力取决于原始存在的群体密度、菌种或环境赋予菌种的抵抗力。灭菌是获得纯培养的必要条件，也是食品工业和医药领域中必需的技术。
将培养基、发酵设备或其他目标物中所有微生物的营养细胞及其芽胞（或孢子）杀灭或去除，从而达到无菌的过程。

灭菌原则

1 灭菌基本要求

重复使用的诊疗器械、器具和物品，使用后应先清洁，再进行消毒或灭菌。被朊病毒、气性坏疽及突发不明原因的传染病病原体污染的诊疗器械、器具和物品，应执行WS/T 367第11章的规定。耐热、耐湿的手术器械，应首选压力蒸汽灭菌，不应采取化学消毒剂浸泡灭菌。环境与物体表面，一般情况下先清洁，再消毒；当受到患者血液、体液等污染时，先去除污染物，再清洁与消毒。医疗机构消毒工作中使用的消毒产品应经卫生行政部门批准或符合相应标准技术规范，并应遵循批准使用的范围、方法和注意事项

2方法的选择

根据物品污染后导致感染的风险高低选择相应的消毒或灭菌方法：1）高危险度物品，应采用灭菌的方法处理；2）中危险度物品，应采用达到中水平消毒以上效果的消毒方法；3）低危险度物品，宜采用低水平消毒方法，或做清洁处理；遇有病原微生物污染时，针对所污染的病原微生物种类选择有效的消毒方法根据物品上污染微生物的种类、数量选择消毒或灭菌的方法：1) 对收到致病菌芽孢、真菌孢子、分枝杆菌和经学传播病原体污染的物品，应采用高水平消毒或灭菌；2）对受到真菌、亲水病毒、螺旋体、支原体、衣原体等病原微生物污染的物品，应采取中水平以上的消毒方法；3）对受到一般细菌和亲脂病毒等污染的物品，应采用达到中水平或低水平的消毒方法；4）杀灭被有机物保护的微生物时，应加大消毒剂的使用剂量和/或延长消毒时间；5）消毒物品上微生物污染特别严重时，应加大消毒剂的使用剂量和/或延长消毒时间；

3 灭菌方法

1）耐热、耐湿的诊疗器械、器具和物品，应首选压力蒸汽灭菌；耐热的油剂类和干粉类应采用干热灭菌；2）不耐热、耐湿的物品，宜采用低温灭菌方法如环氧乙烷灭菌、过氧化氢低温等离子体灭菌或低温甲醛蒸汽灭菌等；3）物品表面消毒，宜考虑表面性质，光滑表面宜选择合适的消毒剂擦拭或紫外线消毒器近距离照射；多孔材料表面宜采用浸泡或喷雾消毒法。

方法概述

灭菌常用的方法有化学试剂灭菌、射线灭菌、干热灭菌、湿热灭菌和过滤除菌等。可根据不同的需求，采用不同的方法，如培养基灭菌一般采用湿热灭菌，空气则采用过滤除菌。

1、热灭菌法

热灭菌法利用高温使微生物细胞内的一切蛋白质变性，酶活性消失，致使细胞死亡。通常有干热、湿热和间歇加热灭菌等法。2、干热灭菌

火焰灼烧法或烘箱内热空气灭菌法称为干热灭菌法（dryheatsterilization）。把金属器械或洗净的玻璃器皿放入电热烘箱内，在150～170℃下维持1～2小时后，可达到彻底灭菌（包括细菌的芽孢）的目的。灼烧（incineration或combustion）是一种最彻底的干热灭菌法，应用范围仅限于接种环、接种针的灭菌或带病原菌的材料、动物尸体的烧毁等。

3、湿热灭菌

以沸水、蒸气和蒸气加压灭菌。巴氏消毒法：因最早由法国微生物学家巴斯德用于果酒消毒，故名。这是一种专用于牛奶、啤酒、果酒或酱油等不宜进行高温灭菌的液态风味食品或调料的低温消毒方法。巴氏灭菌法就是湿热灭菌，此法有两种方式 ，①经典的低温维持法（lowtemperatureholdingmethod，LTH）：在61.7～62.8℃下处理30分钟；②较现代的高温瞬时法（hightemperatureshorttime或flushpoint，HTST）：在71.6℃或略高温度下处理15分钟。在上述诸法中，以蒸气加压灭菌效果最好，可用常压蒸气灭菌，也可在高压蒸气锅中（一般使用1千克/厘米2）灭菌,其蒸气温度可达121℃,能将耐热的芽孢在30分钟内全部杀死。但对某些易被高压破坏的物质，如某些糖或有机含氮化合物，宜在0.6千克/厘米2压力下(110℃)灭菌15～30分钟。煮沸消毒法：采用在100℃下煮沸数分钟的方法，一般用于饮用水的消毒。

1、间歇灭菌

间歇灭菌连续3天,每天进行一次蒸气灭菌的方法。此法适用于不能耐 100℃以上温度的物质和一些糖类或蛋白质类物质。一般是在正常大气压下用蒸气灭菌1小时。灭菌温度不超过100℃,不致造成糖类等物质的破坏，而可将间歇培养期间萌发的孢子杀死，从而达到彻底灭菌的目的。

2、辐射灭菌

辐射灭菌在一定条件下利用射线进行灭菌的方法。较常用的有紫外线，其他还有电离辐射（射线加快中子等）。波长在25000～80000纳米之间的激光也有强烈的杀菌能力,以波长26500纳米最有效。辐射灭菌法仅限于某一定材料，因所需设备复杂，难于广泛使用。

3、渗透压灭菌

渗透压灭菌利用高渗透压溶液进行灭菌的方法。在高浓度的食盐或糖溶液中细胞因脱水而发生质壁分离，不能进行正常的新陈代谢，结果导致微生物的死亡。

4、化学试剂灭菌

大多数化学药剂在低浓度下起抑菌作用,高浓度下起杀菌作用。常用5%石炭酸、70%乙醇和乙二醇等。化学灭菌剂必须有挥发性，以便清除灭菌后材料上残余的药物。化学灭菌常用的试剂有表面消毒剂、抗代谢药物（磺胺类等）、抗生素、生物药物素抗生素是一类有微生物或其他生物生命活动过程中的合成的次生代谢产物或人工衍生物，他们在很低浓度时就能抑制或感染它种生物（包括病原菌，病毒，癌细胞等）的生命活动，因而可用作优良的化学治疗剂。

具体操作

1 概述

灭菌，可称为除去或杀灭物质中全部微生物。就一般灭菌方法来说，应根据微生物的种类、污染状况、被污染物品的性质与状态，对下述灭菌方法可单独或合并使用。是否达到灭菌的目的，通常情况下要采用无菌试验法进行判定。对灭菌操作时的温度、压力等是否适合灭菌的条件，必须得到十分的确认。在灭菌条件选定后，还要进行灭菌效果的确认，以保证使用的各种灭菌条件适合于要杀灭的目标菌。

2加热灭菌

使用加热灭菌法，在温度和压力等规定的灭菌条件下，要达到一定的加热时间，因灭菌物品的性质、灭菌容器的容积大小各异，所以，灭菌时间是从容器内全部达到规定的温度时开始计算。

1、火焰灭菌法，是利用火焰加热杀灭微生物的一种方法。本办法以燃气为主，用于磁制与金属制口及在火焰中不会破损的物品。加热时间通常在喷灯或酒精的火焰中加热秒以上。

2、干热灭菌法，是利用干热空气加热杀灭微生物的一种方法。本办法以燃气为主，用于磁制、金属制若干物品，纤维制物品，矿物油、脂肪、脂肪油、试验药物、固态的医药品等耐高温的物品；利用燃气和电能直接加热空气，将加热的空气进行循环，保持干燥与高温状态。通常，在以下几种条件下进行灭菌。135℃～145℃ 3～5小时；160℃～170℃ 2～4小时；180℃～200℃ 0.5～1小时；200℃以上0.5小时以上。在密封容器中装入医药品、水溶液等，这些物品属耐高温的物品，可用134℃～138℃的热空气，加热3分钟以上进行灭菌。

3、高压蒸气灭菌法，是利用适当温度和压力的饱和水蒸气加热杀灭微生物的一种方法。本办法以燃气为热源，用于磁制、金属制、橡胶制、纸制、纤维制的物品、水、培养基、试验药品、试验液体和液态医药品等的灭菌，总之，用于耐高温高压水蒸气的物品。为确实达到灭菌，灭菌容器中的原有空气在操作中要从排气中排除，进行灭菌时，高压蒸气必须饱满。通常可在以下条件下进行灭菌。115℃（0.7kg/cm2;）30分钟；121℃（1.0kg/cm2;）20分钟；126℃（1.4kg/cm2;）15分钟。

4、流通蒸气灭菌法，利用直接加热的流通水蒸气杀灭微生物的方法。本办法以燃气作为热源，对磁制、金属制、橡胶制、纤维制的物品、水、培养基、试验药品、试验液和液状的医药品等进行灭菌。用干热灭菌法或高压蒸气灭菌法，物品有变质的危险，所以在100℃流通水蒸气中灭菌需30～60分钟。

5、煮沸灭菌法，利用沉没在沸腾水中加热杀灭微生物的一种方法。本办法以燃气为能源，对磁制、金属制、橡胶制、纤维制的物品、水、培养基、试验药品、试验液体、液状的医药品等进行灭菌，用干热灭菌法和高压蒸气灭菌法进行灭菌的物品有变质的危险。所以为增加杀菌效果，可以在沸腾水中加入1—2%的碳酸氢钠。将物品沉入沸腾水中进行灭菌时，煮沸时间应在15分钟以上。

6、间歇灭菌法，是利用80℃～100℃水或流通水蒸气，24小时为一周期，每隔30～60分钟反复加热3—5回；用来杀灭微生物的一种主法。用60℃～80℃的水反复加温也是一种间歇式低温灭菌方法。本办法主要用于以橡胶为主的制品，培养基、试验用药品、液体和液态状的医药等。

3过滤灭菌

过滤灭菌法，即用筛除或滤材吸附等物理方式除去微生物,是一种常用的灭菌方法。对不耐热液体,过滤是唯一实用的灭菌方法. 滤器可分为深层型和过筛型两大类。深层滤器主要靠滤材的深度,通过机械性捕获或随机吸附进行过滤,多数滤材属此类型。过筛型滤器以物理过筛法将液体或气体中。有些需要灭菌的材料不能受热，例如许多维生素溶液。因此，许多液体可以用过滤法来灭菌。过滤法不是将微生物杀死，而是把它们排除出去。过滤除菌采用两类器具，一类叫深层滤器，例如用烧结玻璃、不上釉的陶瓷颗粒或石棉压成的滤板等：另一类是滤膜。深层滤器已经使用了100年以上，有逐渐被滤膜取代的趋势，但因为大量沉淀物容易堵塞滤膜，所以一般先用深层滤器除去大的颗粒。滤膜一般由醋酸纤维素、硝酸纤维素、多聚碳酸酯、聚偏氟乙烯等合成纤维材料制成。滤膜的孔径一般为0.2微米，它可以滤除绝大多数微生物的营养细胞。过滤法的最大缺点是不能滤除病毒。全办法主要用于气体、水、含有可溶性、不稳定物质的培养基、试验液体和液状医药品等。通常使用的过滤装置有膜过滤器，磁制过滤器、玻璃纤维过滤器等。

4照射灭菌

1、放射线灭菌法，包括放射性同位素在内的，利用从放射源产生γ射线进行照射，是杀灭微生物的一种方法。本办法，主要用于玻璃制品、磁制品、金属制品、橡胶制品、塑料制品与纤维制品等耐受放射线照射的物品。通常使用的放射源有60CO、137C5等，根据进行灭菌物品的材质、性状和污染状况等，对照射的总线量进行调节，以达到灭菌的目地。

2、紫外线灭菌法，是利用照射紫外线杀灭微生物的一种方法。本办法主要用于玻璃制品、金属制品、橡胶制品、塑料制品和纤维制品等，还可用于设施、设备、水或医药品等，这些物品应对紫外线有良好的耐受性，通常，一般应用200—300nm的紫外线。

3、高频灭菌法，是直接用照射高频发热杀灭微生物的一种方法。本办法主要用于水、培养基、试验液体和液状的医药品等耐受高频照射的物品。通常采用915或2450兆周的频率。

5化学灭菌

1、气体灭菌法，利用环氧乙烷或甲醛性杀微生物的一种方法。本办法主要用于玻璃制品、磁制品、金属制品、橡胶制品、塑料制品、纤维制品等，用于设施、设备或粉末状的医药品等，使用气体灭菌时，其被灭菌的物品以未变质为前提条件。

2、药液灭菌法，是用药液杀灭微生物的方法。本办法主要用于玻璃制品、磁制品、金属制品、橡胶制品、塑料制品、纤维制品等物品的灭菌，还可用于手指、无菌箱或无菌设备等的消毒，药液灭菌用于未变质的物品。通常使用的有乙醇（酒精）0.1—1w/v%盐化苯类溶液、甲酚、苯酚水或福尔马林水等。

6无菌操作

将以上已经使用过的器具或材料在灭菌后，应在无菌箱或无菌设备内进行无菌操作。以上各种灭菌方法，主要用于医药品的调配、充填、密封等工艺性的操作，操作速度要快。

21世纪尖端科技300-600Mpa超高压灭菌，国际公认的是该技术应用设备价格昂贵，中国主要靠进口，造成了超高压技术的应用瓶颈。国内少有几家企业在开始生产超高压设备，预计2012年可打破进口价格昂贵的应用瓶颈。

灭菌参数灭菌设备的验证是通过有关参数对灭菌方法进行可靠性验证的。

1、D值D值是指在一定温度下，杀灭90%微生物（或残存率为10%）所需的灭菌时间。在一定灭菌条件下，不同微生物具有不同的D值；同一微生物在不同灭菌条件下，D值亦不相同。因此D值随微生物的种类、环境和灭菌温度变化而异。

2、Z值Z值是指灭菌时间减少到原来的1/10所需升高的温度或在相同灭菌时间内，杀灭99%的微生物所需提高的温度。

3、F值F值为在一定温度（T）下，给定Z值所产生的灭菌效果与在参比温度（T0）下给定Z值所产生的灭菌效果相同时，所相当的灭菌时间，以min为单位。F值常用于干热灭菌。

4、F0值F0值为一定灭菌温度（T）下，Z为10℃时所产生的灭菌效果与121℃，Z值为10℃所产生的灭菌效果相同时所相当的时间（min）。也就是说，不管温度如何变化，t分钟内的灭菌效果相当于在121℃下灭菌F0 分钟的效果。F0仅应用于湿热灭菌。

干热灭菌

（1）干烤：利用干烤箱，加热160～180℃2小时，可杀死一切微生物，包括芽胞菌。主要用于玻璃器皿、瓷器等的灭菌。　　（2）烧灼和焚烧：烧灼是直接用火焰杀死微生物，适用于微生物实验室的接种针等不怕热的金属器材的灭菌。焚烧是彻底的消毒方法，但只限于处理废弃的污染物品，如无用的衣物、纸张、垃圾等。焚烧应在专用的焚烧炉内进行。　　

3）红外线：红外线辐射是一种0.77～1000微米波长的电磁波,有较好的热效应,尤以1～10微米波长的热效应最强。亦被认为一种干热灭菌。红外线由红外线灯泡产生,不需要经空气传导，所以加热速度快，但热效应只能在照射到的表面产生，因此不能使一个物体的前后左右均匀加热。红外线的杀菌作用与干热相似，利用红外线烤箱灭菌的所需温度和时间亦同于干烤。多用于医疗器械的灭菌。　　

人受红外线照射较长会感觉眼睛疲劳及头疼；长期照射会造成眼内损伤。因此，工作人至少应戴能防红外线伤害的防护镜。　　

（4）微波：微波是一种波长为1毫米到1米左右的电磁波，频率较高，可穿透玻璃、塑料薄膜与陶瓷等物质，但不能穿透金属表面。微波能使介质内杂乱无章的极性分子在微波场的作用下，按波的频率往返运动，互相冲撞和磨擦而产生热，介质的温度可随之升高，因而在较低的温度下能起到消毒作用。一般认为其杀菌机理除热效应以外，还有电磁共振效应，场致力效应等的作用。消毒中常用的微波有2450MHZ与915MHZ两种。微波照射多用于食品加工。在医院中可用于检验室用品、非金属器械、无菌病室的食品食具、药杯及其它用品的消毒。　　

微波长期照射可引起眼睛的晶状混浊、睾丸损伤和神经功能紊乱等全身性反应，因此必须关好门后才开始操作。

湿热灭菌

（1）煮沸法：煮沸100℃，5分钟，能杀死一般细菌的繁殖体。许多芽胞需经煮潮5～6小时才死亡。水中加入2%碳酸钠，可提高其沸点达105℃。既可促进芽胞的杀灭，又能防止金属器皿生锈。煮沸法可用于饮水和一般器械（刀剪、注射器等）的消毒。　　

（2）流通蒸汽灭菌法：利用100℃左右的水蒸汽进行消毒，一般采用流通蒸汽灭菌器（其原理相当于我国的蒸笼），加热15到39分钟，可杀死细菌繁殖体。消毒物品的包装不宜过大、过紧以利于蒸汽穿透。　　

（3）间歇灭菌法：利用反复多次的流通蒸汽，以达到灭菌的目的。一般用流通蒸汽灭菌器，100℃加热15～30分钟，可杀死其中的繁殖体；但芽胞尚有残存。取出后放37℃孵箱过夜，使芽胞发育成繁殖体，次日再蒸一次，如此连续三次以上。本法适用于不耐高温的营养物（如血清培养基）的灭菌。　　

（4）巴氏消毒法（Pasteurization）：利用热力杀死液体中的病原菌或一般的杂菌，同时不致严重损害其质量的消耗方法。由巴斯德创用以消毒酒精类，故名。加温61.1～62.8℃半小时，或71.7℃15～30分钟。常用于消毒牛奶和酒类等。　　

（5）高压蒸汽灭菌法：压力蒸汽灭菌是在专门的压力蒸汽灭菌器中进行的，是热力灭菌中使用最普遍、效果最可靠的一种方法。其优点是穿透力强，灭菌效果可靠，能杀灭所有微生物。使用的压力灭菌器可分为两类：下排气式压力灭菌器和预真空压力灭菌器。适用于耐高温、耐水物品的灭菌。

首先，在进入实验室工作之前，所有操作者都应接受生物技术安全实践培训；其次，严格的手卫生，在处理感染性病原体时应戴上手套，如果有溢出或溅出，建议戴两副手套；进行有污染的操作时，不要在微生物学实验室里用脏手触摸脸部、眼睛或嘴；严格遵守实验室内的实践规范，佩戴正确的个人防护用品。

但最重要是，是做好空间灭菌消毒、终末消毒工作，从根源上消除感染风险，不论是实验室或者从业人员都需要对自己的生命负责人。

我们日常生活中熟悉的方法有紫外线照射、化学消毒剂喷雾等等。但是由于紫外线照射需要对被消毒物体表面或气体进行直接照射才有作用，所以在高等级生物安全实验室的消毒灭菌中基本采用气体熏蒸的方式。

气体熏蒸选择的灭菌剂是有讲究的，常见的有甲醛、过氧化氢、二氧化氯等等，杭州美卓生物推荐使用干雾过氧化氢灭菌技术。

过氧化氢具有广谱、高效、速效、无毒、对金属及织物有腐蚀性、受有机物影响大、纯品稳定性好、稀释液不稳定等特点。现有产品中多添加其他成分来稳定过氧化氢，增强其杀菌作用并降低其腐蚀性。过氧化氢消毒的主要优点是干燥、作用快速、无毒、无残留。

该技术应用于欧洲实验室环境消毒已有近20年历史，特别是近几年，在欧盟限制使用甲醛空间灭菌的大环境下过氧化氢灭菌技术得到飞速发展。

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