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核酸提取和纯化控制程序

来源:中国仪器批发网2019-11-20 09:24:01浏览:718
  核酸提取和纯化控制程序
  
  1. 目的:规定DNA和RNA核酸样本提取和纯化实验应遵守的操作。
  
  2. 适用范围:生物样本提取DNA和RNA核酸,并包括对核酸样品的长期保存。
  
  3. 基本定义和术语:
  
  DNA,脱氧核糖核:基因组DNA构成了生物体的完整遗传信息。几乎所有生物体的基因组组成都是DNA,仅有的例外是具有RNA基因组的部分病毒。不同生物体的染色体的尺寸、数量,以及基因组DNA的性质各异。病毒DNA基因组相对较小,可以为单链或双链,线状或循环状。所有其它生物体的基因组都是双链DNA形式。细菌具有单个循环状的染色体。在真核生物体内,多数基因组DNA位于细胞核内(核内DNA),构成多条不同尺寸的线状染色体。此外,在真核细胞的线粒体内,以及植物和低等真核生物的叶绿体内,也额外含有基因组DNA。这一类DNA通常为环状分子,以这些细胞器内的多拷贝形式存在。质粒DNA为细菌内双链闭合环状DNA分子,大小为1 kb 到大于200 kb不等。质粒中通常含有编码(在部分环境下)有利于宿主细胞的酶的基因。这些编码的酶可能会参与抵制环境内检出的毒素(例如,复杂的有机复合物)或者细菌自身产生的毒素,或生成相应的抗体。质粒DNA纯化后,可用于测序、PCR、蛋白表达、转染以及基因疗法等一系列下游应用。
  
  RNA,核糖核酸:RNA是具有多种不同的功能的生物大分子。信使RNA(mRNA)是DNA转录得到的,用做蛋白质合成的模板。蛋白质的合成是由核糖体完成的,核糖体由核糖体RNA(rRNA)和蛋白质组成。非编码RNA也是非常重要的,它们通常在基因表达的调控中发挥作用。一个典型的快速生长的哺乳动物细胞培养中,每个细胞大约含有10–30 pg的RNA,而一个完全分化的原代细胞中,RNA的量要少得多——大约每个细胞中RNA的含量小于1 pg。细胞中的RNA分子主要是tRNA和rRNA。mRNA大约占细胞中RNA总量的1–5%,但是具体的量取决于细胞类型和细胞的生理状态。一个动物细胞中,大约有360,000个mRNA分子,组成了大约12,000个转录本,一个典型转录本的长度大约为2 kb。一些mRNA分子占到了总mRNA的3%,而其它的mRNA分子的含量低于0.01%。这些“稀有的”或者“低丰度”的mRNA分子在每个细胞中只有5–15个拷贝。但是,这些稀有的mRNA大约有11,000种,占到了mRNA数量的45%。一个生物体中的基因是相对固定的,因此,mRNA的组成代表了在给定的条件下,基因的表达方式。使用杂交技术,包括RNA印迹法(northern印迹)和微阵列分析,或RT-PCR技术、转录本测序技术(RNA-seq)对RNA进行分析,能够充分反映一个生物体中的基因表达谱。
  
  4. 设备和器材:低温冰箱,烤箱,高速冷冻离心机,各种规格的加样器,DNase与RNase free的pipet头、1.5ml和2ml离心管,研砵、研棒,金属药勺,金属镊子等。
  
  5. 正文
  
  ① 实验室设置:实验室内各操作区域应相对独立,设备物品如加样器应尽可能专用。
  
  ② DNA提取处理规范:DNA是一种相对稳定的分子。但应避免在DNA溶液中引入核酸酶,因为此类酶会造成DNA降解。基因组DNA由超大的DNA分子构成,因此较为脆弱,极易被破坏。为确保基因组DNA的完整性,应避免进行过多和过于粗糙的移液和涡旋振荡操作。DNA储存在水中时,极易酸性水解,长期储存时建议将其储存在TE缓冲液中。
  
  ③ RNA提取处理规范:处理RNA时,一定要使用合适的微生物学的无菌技术。手和灰尘颗粒可能会携带细菌和霉菌,是最常见的核糖核酸酶污染源。为了阻止来源于皮肤表面或者实验室器械灰尘上的核糖核酸酶污染,在操纵试剂以及RNA样品的时候,一直要佩戴乳胶手套或者乙烯基手套(PVC手套)。可能的情况下,要经常更换手套,并将试管处于关闭状态。当用移液管吸取溶液用于下游应用时,要将纯化过的RNA放在冰上。可以高温烘烤的设备250℃干烤8h以上;不宜高温烘烤的材料,0.1%DEPC浸泡后高压处理。关键操作步骤推荐在超净工作台内进行,佩戴一次性手套与口罩。
  
  6. 质量控制
  
  DNA质量控制
  
  可采用分光光度法(Nanodrop)测定DNA浓度和质量
  
  DNA和RNA的浓度应通过分光光度计测定260 nm (A260)下的吸光度来测定。出于准确度需要,260 nm下的吸光度读数应将至0.15到1.0之间。在10 mM Tris•Cl、pH 8.5条件下,纯净的DNA的A260/A280比率约等于1.8。
  
  A260/A280 大于1.9表示有RNA污染。
  
  A260/A280 小于1.6表示有蛋白质等污染物存在。
  
  在270 nm和275 nm处的强吸光度则表示存在污染物苯酚。
  
  在325 nm处的吸光度表示很可能存在溶液或脏污的器皿造成的污染。
  
  RNA质量控制
  
  分光光度计检测RNA的浓度和质量(推荐使用Nanodrop)
  
  在260 nm与280 nm读值之间的比例(A260/A280)能够反映RNA的纯度,因为如蛋白一类的污染物会吸收紫外光。不过,A260/A280的比值也受到pH值的显著影响。当使用没有缓冲能力的水时,pH值与A260/A280的比值结果都会发生大范围的改变。较低的pH值会导致A260/A280的比值变小,对蛋白质污染的敏感性也会随之降低。
  
  纯RNA的A260/A280 比率约为1.8–2.1。
  
  比值低于1.7说明有蛋白质或酚类污染。
  
  RNA的完整度检测
  
  总RNA的完整度和大小分布可以通过变性的琼脂糖凝胶电泳、溴化乙锭染色或市售的检测系统(如QIAxcel系统或Agilent 2100 )进行检测。每条核糖体RNA的富集区域在凝胶染色之后应显现为锐利的条带。28S核糖体RNA的条带亮度应为18S rRNA条带的两倍左右。如果某一泳道中核糖体RNA条带不够锐利,却出现小尺寸RNA的弥散情况,则很可能因为RNA样品在制备过程中发生了严重的降解。
  
  Agilent 2100 Bioanalyzer也能够提供RNA完整数目(RNA Integrity Number,RIN)这一参数,作为对RNA完整度的一个有用量度。在理想情况下RIN值应接近10,不过在许多情况下(特别是对组织样本来说),RNA品质主要取决于原始样本的保存情况。
  
  从RNA中去除基因组DNA污染
  
  目前还没有哪一种纯化步骤能保证RNA中不含DNA,即使在琼脂糖凝胶电泳上检测不到DNA。对于低丰度目标序列的研究,残留的DNA污染物对样品的任何干扰,都能够通过real-time RT-PCR 对照实验检测到,在这些对照实验中,PCR反应之前不加入逆转录酶。为了避免real-time RT-PCR 实验中DNA的干扰,推荐设计与内含子的剪接位点相结合的引物,这样就避免了基因组DNA的扩增。也可以使用一些商业化的试剂盒,在cDNA合成时,去除基因组DNA。

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