核酸提取和纯化控制程序

　　核酸提取和纯化控制程序
　　
　　1. 目的：规定DNA和RNA核酸样本提取和纯化实验应遵守的操作。
　　
　　2. 适用范围：生物样本提取DNA和RNA核酸，并包括对核酸样品的长期保存。
　　
　　3. 基本定义和术语：
　　
　　DNA，脱氧核糖核：基因组DNA构成了生物体的完整遗传信息。几乎所有生物体的基因组组成都是DNA，仅有的例外是具有RNA基因组的部分病毒。不同生物体的染色体的尺寸、数量，以及基因组DNA的性质各异。病毒DNA基因组相对较小，可以为单链或双链，线状或循环状。所有其它生物体的基因组都是双链DNA形式。细菌具有单个循环状的染色体。在真核生物体内，多数基因组DNA位于细胞核内（核内DNA），构成多条不同尺寸的线状染色体。此外，在真核细胞的线粒体内，以及植物和低等真核生物的叶绿体内，也额外含有基因组DNA。这一类DNA通常为环状分子，以这些细胞器内的多拷贝形式存在。质粒DNA为细菌内双链闭合环状DNA分子，大小为1 kb 到大于200 kb不等。质粒中通常含有编码（在部分环境下）有利于宿主细胞的酶的基因。这些编码的酶可能会参与抵制环境内检出的毒素（例如，复杂的有机复合物）或者细菌自身产生的毒素，或生成相应的抗体。质粒DNA纯化后，可用于测序、PCR、蛋白表达、转染以及基因疗法等一系列下游应用。
　　
　　RNA，核糖核酸：RNA是具有多种不同的功能的生物大分子。信使RNA（mRNA）是DNA转录得到的，用做蛋白质合成的模板。蛋白质的合成是由核糖体完成的，核糖体由核糖体RNA（rRNA）和蛋白质组成。非编码RNA也是非常重要的，它们通常在基因表达的调控中发挥作用。一个典型的快速生长的哺乳动物细胞培养中,每个细胞大约含有10–30 pg的RNA，而一个完全分化的原代细胞中，RNA的量要少得多——大约每个细胞中RNA的含量小于1 pg。细胞中的RNA分子主要是tRNA和rRNA。mRNA大约占细胞中RNA总量的1–5%，但是具体的量取决于细胞类型和细胞的生理状态。一个动物细胞中，大约有360,000个mRNA分子，组成了大约12,000个转录本，一个典型转录本的长度大约为2 kb。一些mRNA分子占到了总mRNA的3%，而其它的mRNA分子的含量低于0.01%。这些“稀有的”或者“低丰度”的mRNA分子在每个细胞中只有5–15个拷贝。但是，这些稀有的mRNA大约有11,000种，占到了mRNA数量的45%。一个生物体中的基因是相对固定的，因此，mRNA的组成代表了在给定的条件下，基因的表达方式。使用杂交技术，包括RNA印迹法（northern印迹）和微阵列分析，或RT-PCR技术、转录本测序技术（RNA-seq）对RNA进行分析，能够充分反映一个生物体中的基因表达谱。
　　
　　4. 设备和器材：低温冰箱，烤箱，高速冷冻离心机，各种规格的加样器，DNase与RNase free的pipet头、1.5ml和2ml离心管，研砵、研棒，金属药勺，金属镊子等。
　　
　　5. 正文
　　
　　①　实验室设置：实验室内各操作区域应相对独立，设备物品如加样器应尽可能专用。
　　
　　②　DNA提取处理规范：DNA是一种相对稳定的分子。但应避免在DNA溶液中引入核酸酶，因为此类酶会造成DNA降解。基因组DNA由超大的DNA分子构成，因此较为脆弱，极易被破坏。为确保基因组DNA的完整性，应避免进行过多和过于粗糙的移液和涡旋振荡操作。DNA储存在水中时，极易酸性水解，长期储存时建议将其储存在TE缓冲液中。
　　
　　③　RNA提取处理规范：处理RNA时，一定要使用合适的微生物学的无菌技术。手和灰尘颗粒可能会携带细菌和霉菌，是最常见的核糖核酸酶污染源。为了阻止来源于皮肤表面或者实验室器械灰尘上的核糖核酸酶污染，在操纵试剂以及RNA样品的时候，一直要佩戴乳胶手套或者乙烯基手套（PVC手套）。可能的情况下，要经常更换手套，并将试管处于关闭状态。当用移液管吸取溶液用于下游应用时，要将纯化过的RNA放在冰上。可以高温烘烤的设备250℃干烤8h以上；不宜高温烘烤的材料，0.1%DEPC浸泡后高压处理。关键操作步骤推荐在超净工作台内进行，佩戴一次性手套与口罩。
　　
　　6. 质量控制
　　
　　DNA质量控制
　　
　　可采用分光光度法（Nanodrop）测定DNA浓度和质量
　　
　　DNA和RNA的浓度应通过分光光度计测定260 nm (A260)下的吸光度来测定。出于准确度需要，260 nm下的吸光度读数应将至0.15到1.0之间。在10 mM Tris•Cl、pH 8.5条件下，纯净的DNA的A260/A280比率约等于1.8。
　　
　　A260/A280 大于1.9表示有RNA污染。
　　
　　A260/A280 小于1.6表示有蛋白质等污染物存在。
　　
　　在270 nm和275 nm处的强吸光度则表示存在污染物苯酚。
　　
　　在325 nm处的吸光度表示很可能存在溶液或脏污的器皿造成的污染。
　　
　　RNA质量控制
　　
　　分光光度计检测RNA的浓度和质量（推荐使用Nanodrop）
　　
　　在260 nm与280 nm读值之间的比例（A260/A280）能够反映RNA的纯度，因为如蛋白一类的污染物会吸收紫外光。不过，A260/A280的比值也受到pH值的显著影响。当使用没有缓冲能力的水时，pH值与A260/A280的比值结果都会发生大范围的改变。较低的pH值会导致A260/A280的比值变小，对蛋白质污染的敏感性也会随之降低。
　　
　　纯RNA的A260/A280 比率约为1.8–2.1。
　　
　　比值低于1.7说明有蛋白质或酚类污染。
　　
　　RNA的完整度检测
　　
　　总RNA的完整度和大小分布可以通过变性的琼脂糖凝胶电泳、溴化乙锭染色或市售的检测系统（如QIAxcel系统或Agilent 2100 ）进行检测。每条核糖体RNA的富集区域在凝胶染色之后应显现为锐利的条带。28S核糖体RNA的条带亮度应为18S rRNA条带的两倍左右。如果某一泳道中核糖体RNA条带不够锐利，却出现小尺寸RNA的弥散情况，则很可能因为RNA样品在制备过程中发生了严重的降解。
　　
　　Agilent 2100 Bioanalyzer也能够提供RNA完整数目（RNA Integrity Number，RIN）这一参数，作为对RNA完整度的一个有用量度。在理想情况下RIN值应接近10，不过在许多情况下（特别是对组织样本来说），RNA品质主要取决于原始样本的保存情况。
　　
　　从RNA中去除基因组DNA污染
　　
　　目前还没有哪一种纯化步骤能保证RNA中不含DNA，即使在琼脂糖凝胶电泳上检测不到DNA。对于低丰度目标序列的研究，残留的DNA污染物对样品的任何干扰，都能够通过real-time RT-PCR 对照实验检测到，在这些对照实验中，PCR反应之前不加入逆转录酶。为了避免real-time RT-PCR 实验中DNA的干扰，推荐设计与内含子的剪接位点相结合的引物，这样就避免了基因组DNA的扩增。也可以使用一些商业化的试剂盒，在cDNA合成时，去除基因组DNA。