核酸提取、纯化相关问题解答

　　核酸是生命的最基本物质之一，可分为DNA和RNA两类，广泛存在于动物、植物细胞、微生物等所有生命体内。不仅起着储存和传递遗传信息的作用，而且在蛋白质的生物合成上也占重要位置，因而在生长、遗传、变异等一系列重大生命现象中起决定性的作用。
　　

　　核酸提取包括DNA提取，RNA提取，质粒提取。核酸是遗传信息的携带者，是基因表达的物质基础，是分子生物学研究的主要对象。无论是进行核酸的结构还是功能研究，首先都需要对核酸进行提取和纯化。

　　
　　核酸提取仪是应用配套的核酸提取试剂来自动完成样本核酸的提取工作的仪器，核酸提取仪分为两类：一类是大型的自动化的，一般称为自动液体工作站；另一类是小型自动核酸提取仪，利用封装好的配套试剂自动完成提取纯化过程。
　　
　　大型自动液体工作站因为设备成本高昂，运行成本高，适合一次提取几千个同一种类标本，所以真正得到应用的比较少；而小型自动化的仪器，因为仪器设备和运行成本低，操作方便得到越来越多的应用。
　　
　　核酸提取纯化方法
　　
　　自1869年核酸被首次发现以来，许多研究者在核酸的提取方法上进行了不懈的探索，对核酸的各种材料和试剂进行了改进，十二烷基磺酸钠、酚、脲和胍盐等各种试剂纷纷被应用到核酸提取实验中，各种用于核酸提取的商品化试剂盒也应运而生。
　　
　　其中，传统的提取方法主要有：酚抽提法、碱裂解法、CTAB抽提法和EtBr-CsCl梯度离心法。这些传统提取方法可从不同组织样本中分离出DNA和RNA，但这些技术中包含沉淀和离心等操作步骤，其所需的生物样本量较大，且提取的步骤较为繁杂、费时费力，得率也不高，难以实现自动化操作。
　　
　　另外，大部分的传统方法中还需要用到有毒化学试剂，对操作人员的健康具有潜在危害，因此，伴随着分子生物学以及高分子材料学的发展，从液相系统中分离核酸的传统技术逐渐被以固相载体为基础的新方法所取代。
　　
　　固相载体吸附法：
　　
　　以固相吸附物载体为基础的新型核酸提取方法主要有：旋转离心柱提取法、玻璃珠吸附法、二氧化硅基质法、阴离子交换法和纳米磁珠提取法。这类方法的操作步骤主要可分为三个部分：
　　
　　（1）利用裂解液促使细胞破裂，使核酸释放于液相中
　　
　　（2）利用载体对核酸的较强亲和力和吸附力，将释放出来的核酸特异性地结合在特定载体上，使蛋白质、多糖和脂类等其它杂质依然游离于液相中，随上清的移走而被除去，
　　
　　（3）通过调节洗脱液的离子强度和pH值，将吸附于载体上的核酸洗脱下来而得到纯化后的核酸。
　　
　　其中，离心柱法DNA提取试剂盒以其低廉的价格和相对便捷的操作，在市面上应用得较为广泛，但随着对DNA提取需求量的增多，离心柱法提取DNA的缺点也日益凸显。样本需求量大，损失多，对于珍稀样本无能为力等成为离心柱法无法避免的缺点，同时离心柱法DNA提取过程需要反复离心，不便于高通量、自动化操作，与现代生物学实验要求格格不入。
　　
　　为了适应现代分子生物学高通量，高灵敏度，自动化操作的发展需求，20世纪90年代，磁珠法DNA提取技术由此诞生，其原理是磁珠表面带有特定的活性基团，在特定条件下能够与核酸进行特异性可逆结合，同时利用磁珠自身具备的磁响应能力，在外加磁场的作用下可方便地进行定向移动与富集，进而实现对核酸的分离纯化。
　　
　　磁珠法核酸提取的优势：
　　
　　磁珠法DNA提取是纳米科技与生物技术的完美结合，具有其它DNA提取方法不可比拟的优势：
　　
　　1.样本需求量低：微量的材料即可提到高浓度的核酸；
　　
　　2.操作简单快速：整个操作流程基本分为五步（裂解、结合、洗涤、干燥、洗脱），全程无需离心操作，大多可在30~60分钟内完成；
　　
　　3.质量稳定可靠：游离的磁珠与核酸的结合量更大，特异性的结合使得核酸纯度更高，且可通过控制磁珠表面基团来调节核酸回收量；
　　
　　4.全自动化操作：采用核酸提取仪可实现自动化、高通量操作，一键启动，即可实现几十甚至几百个样品的提取；
　　
　　5.安全无毒无害：试剂不含酚、氯仿等有毒化学试剂，完全符合现代化环保理念。
　　
　　磁珠法核酸提取注意事项：
　　
　　使用生物磁珠提取核酸，在国内还属于较为新颖的核酸提取方式，相比于传统的异戊醇抽提法和离心柱试剂盒法，这种方法还有很多人不慎了解，在使用磁珠法提纯核酸的过程中，也存在着一些误区。
　　
　　1.误区一：磁珠使用的越多，提取效果越好
　　
　　有很多老师喜欢在提取效果不佳的时候，增加磁珠的用量，认为磁珠多加一点，就能吸上更多的核酸，不得不说这种想法是不可取的。
　　
　　磁珠的主要特点是既可以分散于液体中，也可以在外加磁场作用下以固态方式和液相分离，任何试剂体系，磁珠和液体的比例都应该是有一定阈值的，超过一定的比例，过多的磁珠将因为无法均匀分散于液体中，而丧失其分散的特性，也使得洗涤过程中无法充分增加核酸磁珠和液体接触的效率。而过量的磁珠也会吸附更多的杂质，对于除杂的效果影响非常大。甚至有些时候，过多的磁珠会吸附蛋白酶、溶菌酶等在液体体系中起主要作用的功能成分，导致整个试剂盒效率低下。有很多时候，在提取效果不佳的时候，减少磁珠使用量，反而是提升提取效果的最优途径。
　　
　　通常情况下，磁珠法试剂盒给出的参考磁珠用量都是略微过量的，因此需要增加磁珠用量改善吸附效率的情况并不多，但如果确定是磁珠用量不足导致的提取效果不好，是可以在一定范围内通过增加磁珠用量来改善提取效果的。
　　
　　2.误区二：试剂使用的越多，提取效果越好
　　
　　裂解效果不好？多加点裂解液。洗涤效果不好？多加点洗涤液。这是很多客户在使用试剂盒中的惯性思维。
　　
　　但是对于磁珠法而言，每增加一部分液体体积，就减少了更多的磁珠碰撞几率，而降低磁珠碰撞几率，会导致吸附率的大幅度下降。所以很多时候，虽然增加裂解液和洗涤液确实能够起到增强裂解和增强洗涤的作用，但磁珠法提取的核心是磁珠吸附核酸的效率，无法保证磁珠碰撞效率是不能保证核酸提取效率的，所以单纯增加试剂使用量改善提取效果并不一定完全有效。
　　
　　3.误区三：洗涤次数越多，提取效果越好
　　
　　提取得到的核酸杂质过多时，使用者会考虑多进行几次洗涤，以得到更为纯净的核酸。增加洗涤次数确实有利于提纯核酸，但考虑到每次洗涤都会损失一定量的核酸，且增加了核酸断裂水解的可能性，所以一般来说洗涤次数控制在2~4次为宜。
　　
　　4.误区四：样本取用的越多，提取效果越好
　　
　　在样本不够新鲜或者核酸含量本身就很少的情况下，往往核酸提取效果不好，很多老师就会采用多取样本的方式增加核酸提取量。
　　
　　但简单地增加样本取样量，有时会引入过多的杂质，超出裂解液裂解能力，也会使提取效率降低，所以并不推荐通过简单的增加样本取样量的方式来达到增加提取量的目的。
　　
　　如果确实是由于样本量不足而引起的提取量过低，建议在前处理先经过富集或者浓缩步骤再开始提取。或者增加裂解的完全性，使更多的核酸暴露出来也是一种解决方法。
　　
　　5.误区五：某一种磁珠好，就应该在所有试验中效果都好
　　
　　磁珠的种类是多种多样的，粒径大小不同，分散性不同，磁响应时间不同，包被基础基质不同，外层修饰官能团不同，包被密度不同，官能团臂长不同，会导致磁珠特性千差万别。
　　
　　所以不同磁珠所适应的实验和体系也是不同的。就像同样是核酸提取的试剂，配方也并不完全相同，同样应用于核酸提取的磁珠，性质也并非完全一致。
　　
　　有的磁珠在常量核酸提取中表现出了更高的吸附效率，有的磁珠更适用于微量核酸提取。有的磁珠适合偏酸性系列的试剂体系，有的磁珠适合偏碱性系列的试剂体系。有的磁珠磁响应性好但是沉降速度快，更适合磁棒式自动提取仪；有的磁珠沉降速度慢但是磁响应时间长，更适合移液式自动提取仪。
　　
　　很少有一种磁珠能适用于所有实验的情况，除了固定的试剂盒配合，多数情况下，磁珠和试剂体系都要做一定时间的配合调整。
　　
　　6.误区六：和某种试剂盒对比效果不好，就是磁珠不好
　　
　　很多客户在筛选磁珠过程中都是在已经成熟试剂体系下，简单地等量替换磁珠，用于比较磁珠效果。
　　
　　这样就会很容易得出某种磁珠效果不好的结论，但实际上，由于不同磁珠适合的体系和用量是不同的，往往需要调整过后才能获得更好的提取效果。
　　
　　核酸提取纯化核心参数
　　
　　抽提原理、机械原理、抽提时间、样品处理量、样品管容量、Tip头处理量、Tip头数量、接口、仪器重量、仪器尺寸
　　
　　核酸提取纯化应用领域
　　
　　几乎在每个实验室，与生物分子相关的分离纯化工作都是十分重要，且必不可少的。但要对多个样品进行纯化还是相当困难的，不仅需要选择合适的纯化技术，而且工作量也特别大，很难满足当前飞速发展对高通量样品进行提取纯化的需求。广泛地应用在基因组学、CDC、临床样品的分子诊断、畜牧兽医、法医学领域。

　　核酸提取纯化常见问题

　　
　　Q1：提取质粒加入B uffer 3之后，提高离心速度和离心时间，对于提取产物有何影响？
　　
　　答：加入Buffer 3之后提高立新速度和离心时间确实有利于沉淀贴壁更加紧密，但是常温下离心时间过长会使液体温度升高，造成质粒降解。一般情况下可以4℃、12000rpm离心10min，或者常温下12000rpm离心3-4min即可。
　　
　　Q2：琼脂糖凝胶回收时，如回收DNA片段过短怎么样处理？
　　
　　答：如果回收DNA片段小于500bp时，为了提高回收效率，可以在加入凝胶液溶解凝胶后，加入1.5倍体积凝胶块体积的异丙醇，并充分颠倒混匀。
　　
　　Q3: 琼脂糖凝胶回收时，如何处理凝胶液溶胶后的颜色异常？
　　
　　答：凝胶液完全溶胶后，正常颜色应该是浅黄色。如果颜色变为红色或者橙色之后，需要加入5μl 5M NaAc（pH5.2）调节溶液的pH值，是混合物的颜色恢复为正常的浅黄色（如不调节pH值，会影响DNA的回收率）。
　　
　　Q4: 基因组DNA提取的时候，如何确定裂解液体积与样品质量的关系：
　　
　　答：理论上，裂解液的体积越大、样品的量越少，提取产物的质量越好。因此裂解液体积与样品质量的最佳比例应在实验前摸索优化。如下仅为1ml裂解液能够裂解样品量的推荐数值，仅供参考。
　　
　　Q5: 基因组DNA提取时，采取哪些方法可以提高产物得率？
　　
　　答：
　　
　　（1）适当加大裂解液体积与样品质量的比例。
　　
　　（2）洗脱液提前预热至65℃ 左右，同时洗脱液上柱时要小心加到吸附膜的中间部位，并确保液体将膜全部覆盖。
　　
　　（3）样本裂解后的混合液上柱时如体积过大，需要分次上柱，并且确保每次上样量不超过700μl。
　　
　　（4）适当延长组织的匀浆和裂解时间。
　　
　　Q6：提取产物的A260/A280比值较高的原因？
　　

　　答：纯净的DNA的A260/A280比率在1.8-2.0之间，如样品中RNA的残留量较多，则会造成A260/A280的比较较高，需要在提取过程中加入RNase A（如提取过程中按照说明书加入了RNase A，则要考虑RNase活性降低的可能性）。

　　
　　Q7: 血液基因组DNA提取之前的样本处理注意事项？
　　
　　答：
　　
　　（1）人血液中含有大量可能干扰下游DNA分析的酶抑制剂，另外诸如干扰素、EDTA等通用的抗凝剂还会干扰下游检测。因此从人血液中分离DNA时，需要具备可提供不含污染物和酶抑制剂的优质DNA的方法。
　　
　　（2）哺乳动物的红细胞中不含有核酸，但健康的哺乳动物血液中红细胞含量要超过含有核酸的白细胞（包括淋巴细胞、单核白细胞、颗粒性白细胞等）近1000倍，因此在提取基因组DNA之前去除红细胞可提高DNA产量，推荐方法如下：
　　
　　a.选择性溶解红细胞：在低渗缓冲液条件下，红细胞会较早低渗休克和快速破裂。
　　
　　b.Ficoll密度梯度离心法，可回收单核细胞（淋巴细胞和单核细胞）并去除红细胞（此方法还可去除粒细胞）。
　　
　　c.室温下对全血进行3300g离心10min，离心后会分成三层：上清层为质粒；中间层为白细胞层；底层含有浓缩的红细胞。
　　
　　d.鸟类、鱼、青蛙的红细胞含有核酸，因此不需要处理红细胞。
　　
　　e.血液样本（包括经过红细胞去除处理的血液样本），可采用裂解液和蛋白酶或蛋白酶K有效裂解。
　　
　　f.除动物基因组DNA外，也可以从血液中分离病毒和细菌DNA。
　　
　　Q8：总RNA提取的时候，如何确定裂解液和样本量的关系？
　　
　　答：理论上，裂解液的体积越大、样品的量越少，提取产物的质量越好。因此裂解液体积与样品质量的最佳比例应在实验前摸索优化。如下仅为1ml裂解液能够裂解样品量的推荐数值，仅供参考。
　　
　　Q9：总RNA提取时样本的处理方式？
　　
　　答：
　　
　　（1）理论上越新鲜的样本，提取的总RNA质量越好。如果不能及时提取，需要使用液氮迅速冷冻样本，然后一直储存于-80℃条件下。 样本的反复冻融对于提取RNA的质量有很大的影响。
　　
　　（2）破碎：组织结构、细胞壁和细胞质膜的彻底破碎对于释放样本中所有的RNA是绝对必要的。不同的样本需要使用不同的方法以达到彻底的破碎效果。不完全的破碎会导致RNA得率的显著降低。
　　
　　（3）匀浆：匀浆对于减少破碎后细胞裂解产物的粘性是十分必要的。匀浆能切断高分子量的基因组DNA以及其它高分子量的细胞组分，得到均匀的裂解产物。匀浆不彻底会导致RNA结合效率的下降而显著降低得率。
　　
　　（4）不同样本处理方法建议
　　
　　Q10：RNA提取后如何定量？
　　
　　答：
　　
　　（1）检测RNA样本时，需确保比色杯中去除了RNA酶，特别是测定之后仍需回收这些RNA的情况下（操作方法可按照通过使用0.1M NaOH、1mM EDTA和不含RNase水的顺序来依次洗涤）。
　　
　　（2）使用紫外通透塑料比色杯的分光光度计时，测量A260的吸光值时，读数应该在0.15-1.0之间，A260波长下，1个单位的吸光值对应44μg/ml的RNA浓度（这一相关性仅对中性pH值条件下的检测有效。因此如需稀释RNA样品，应使用如pH7.0、10mM Tris HCl的中性pH值的低盐缓冲液。）