吸光度与复杂的蛋白消光系数

奥盛 微量分光光度计 Nano-500 

　　含有芳香侧链的氨基酸（酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸）具有强烈的紫外吸收能力。因此，蛋白与肽的浓度和其芳香族氨基酸含量与紫外吸光度是成比例的。一旦确定了给定蛋白的吸光度（氨基酸已确定），其蛋白浓度可以通过吸光度来确定。

　　
　　紫外吸收法用于蛋白浓度检测时，最低浓度可达0.1mg/mL，但是对于成分复杂的蛋白溶液（比如细胞裂解物），用紫外吸收就很难估计它们的浓度，因为溶液中组成复杂，具有吸光系数不同的蛋白，除此之外溶液中的核酸也会影响结果。然而，对于绝大多数实验室条件下，用于科研的水溶性蛋白，测量其在280nm吸光度即可最大限度减少其他化合物的干扰。
　　
　　蛋白和肽在280nm吸光度主要受色氨酸、酪氨酸和半胱氨酸的影响，上文提到的苯丙氨酸只在较低波长（240-265nm）下吸收。
　　
　　吸光度和摩尔消光系数
　　
　　透射光强度为P，入射光强度为P0，透光率为T
　　
　　T=P/P0
　　
　　吸光度A，是透光率倒数的对数
　　
　　A = log (1/T)
　　
　　在入射光为平行单色光且垂直照射条件下，特定的波长(λ)下样本的吸光度和物质的摩尔浓度（c），光径长（L）单位厘米，摩尔吸收率(ε)有关：
　　
　　Aλ = εcL
　　
　　比尔定律指出摩尔吸光系数是恒定的（吸光度A和浓度成正比），对于溶解在给定溶质中并在给定波长下测量的给定物质，摩尔吸收率可以称为摩尔吸光系数或摩尔消光系数。又因为透光率和吸光度是没有单位的，所以摩尔消光系数(ε)的单位必须和浓度（c）和光径（L）的单位消除。因此，摩尔消光系数(ε)的单位为M-1 cm-1。因为实验室标准分光光度计比色皿宽通常为1cm，因此，我们通常假定光径为1cm，大多数计算中就不用考虑光径。
　　
　　Aλ = ε c L= ε c（L=1cm）
　　
　　肽或蛋白质在280nm的摩尔吸光系数ε与其色氨酸（W），酪氨酸（Y）和半胱氨酸（C）氨基酸组成有关，该值和这三种氨基酸在280nm处消光系数的加权有关。
　　
　　ε = (nW×5500) + (nY×1490) + (nC×125)
　　
　　其中n是每个残基的数目，5500、1490、125为280nm处氨基酸摩尔吸光系数。
　　
　　通过吸光度来确定蛋白摩尔浓度
　　
　　根据比尔定律c = A / ε L= A / ε（L = 1 cm）
　　
　　我们可以通过用测得的吸光度除以该蛋白的消光系数来获得蛋白摩尔浓，所以必须要知道该蛋白的组成成分并用上一个公式来计算其消光系数。
　　
　　通过对文献阅读发现，对于像肽或蛋白质这样的复杂分子，没有单一的稳定的消光系数，缓冲液类型，离子强度和pH值的微小差异至少会略微影响吸光率，大多数蛋白质制剂，即使是纯度相同的蛋白质制剂，在构象和蛋白修饰略有不同，例如氧化等等这些都会影响吸光率。因此，确定消光系数最好是通过溶解在与样品相同的缓冲液中的已知浓度的蛋白来确定。
　　
　　或者可以通过文献查找例如Practical Handbook of Biochemistry and Molecular Biology中汇编了许多文献中报道过的蛋白消光系数。这些数据对于大多数常规实验室估算蛋白浓度来说已足够准确。报告中大多数蛋白的消光系数大多数是在280nm左右的磷酸缓冲液测得的。
　　
　　1%溶液的摩尔消光系数和吸光度
　　
　　我们可以运用摩尔消光系数利用公式得到样品摩尔浓度
　　
　　A / εmolar =摩尔浓度
　　
　　但许多文章并不直接提供摩尔消光系数，而是以1%（1g/100mL）溶液在1cm比色皿中280nm吸光度来代替。该值可理解为百分比溶液消光系数（εpercent）这也使得消光系数ε的单位从M-1cm-1 变为(g/100mL)-1 cm-1，将其带入公式中，得到的c就是溶液的百分比浓度（1%=1g/100mL=10mg/mL）。
　　
　　即A /εpercent=百分比浓度（%）
　　
　　若想将百分比浓度换算为mg/ml，就需要将百分比溶液消光系数乘以10。
　　
　　即（A /εpercent）*10=浓度（mg/mL）
　　
　　所以摩尔消光系数εmolar 和百分比溶液消光系数εpercent的换算关系为
　　
　　εmolar*10=εpercent×蛋白分子质量（MWprotein）
　　
　　例如想要确定用于蛋白质的具有具有摩尔消光系数43,824M-1 cm-1和分子量（MW）为66,400道尔顿（Da）的百分比溶液消光系数，带入上式进行换算可得：
　　
　　εpercent=（εmolar *10）/（MWprotein）
　　
　　εpercent=（43,824 *10）/（66,400Da）
　　
　　εpercent=6.6g/100mL
　　
　　综上所述，A280法可用于某些蛋白的浓度快速测定，但是需要明确蛋白类型以确定相关参数。