让你一文读懂三代测序技术

　　一、一代测序
　　
　　一代测序又称Sanger测序，Frederick Sanger教授发展了这个方法，并依靠这一重要成果第二次获得诺贝尔奖。（Sanger是史上唯一获得两次诺贝尔化学奖的人，第一次获奖是因为针对蛋白质的研究）。Sanger测序依赖于一类特殊的核苷酸，即ddNTP（双脱氧核苷三磷酸）；这种核苷酸不能形成磷酸二酯键，故会中断DNA的延长。
　　

　　如果用同位素对ATCG四个碱基进行部分标记，电泳后通过放射显影就可以知道这4个碱基出现的位置。例如针对序列ATCGATCGATCG，对A作为终止标记。即可得到三类片段，即A，ATCGA，ATCGATCGA。因此分析可以知道碱基A出现在第1位，第5位和第9位。同样，如果用同样的方法对其他碱基进行标记，也可以测定其余碱基的位置，最终获得待测序列的碱基顺序。

　　
　　
　　这一类测序方法操作简单，因此误差很小。但是缺点也显而易见，就是成本高，通量低，一次只能测一条DNA，而且测序长度有限制。测序极限长度就是能够完整无误的合成出的DNA长度，约为1000bp，对于更长的DNA以及更为复杂的情景，一代测序就无能为力了。因此，为了克服一代测序的局限，二代测序应运而生。
　　
　　二、二代测序
　　

　　二代测序的开发主要是为了解决一代测序长度限制，且通量低效率低的问题。目前，二代测序仪是市场主流，Illumina的测序仪成为了市场霸主。其基本思路就是将长的DNA（或者RNA反转录的cDNA）进行碎片化，之后利用接头将片段化的DNA固定在不同材质的表面。之后进行桥式PCR形成簇状结构，该过程扩增了DNA，相当于放大了信号强度。之后使用不同荧光基团对4种碱基进行标记，就可以根据荧光信号确认新合成的DNA单链时连接上去的碱基。

　　
　　
　　这种测序方法可以做到边合成边测序，与传统第一代测序合成完进行电泳，显影最后得到结果相比，测序效率大大提高。且通过将长DNA片段化后，可以同时进行多个通道的测序，提高通量，减少时间。
　　

　　然而二代测序的缺陷也是显而易见的，即每一片段的读长比较短，大约只有500bp。进行长DNA测序时，需要对结果进行拼接，同样在边合成边测序的策略下，误差来源就是合成时碱基突变（GC突变等）。这就导至对于高度杂合的基因组、高度重复序列、高GC的区域、拷贝数变异等测序，二代测序有非常大的困难。而目前的生命科学研究中，这些问题又非常重要。

　　
　　
　　例如高度重复序列，在基因组中含量超过10%，最初的研究没有理解这些重复片段的意义。经过后续研究发现，这些重复序列与酶的结合，DNA、RNA发夹结构的形成，种属特异性等有直接关系，进而在生理病理过程中发挥非常重要的作用，而这些重复序列的数量和位置，往往不能利用二代测序准确获得。
　　
　　三、三代测序
　　
　　普遍认为三代测序就是单分子测序，即理论上可以进行超长读长，不需要进行PCR扩增的测序。以SMRT（Pacific Biosciences）技术和Oxford Nanopore为代表。
　　

　　其中SMRT技术还是采用了边合成边测序的思路，以及荧光检测的基本技术。SMRT中，碱基采用4种可断裂的荧光标记基团，当被DNA聚合酶合成到新生成的DNA链上时，荧光基团发生脱落，检测不同荧光脱落信号，即可获得序列。然而这一操作很容易被背景杂光干扰，因此该技术中还有一个重要组成部分就是零模波导孔，这是一个足够小的小孔（10nm），小到只能插入一个DNA聚合酶和一条DNA序列，因此在检测的时候可以不受到背景干扰，只探测到一条DNA的信号。这一技术读长可以达到10kbp，且需要样品量极少，非常利于长片段和高度多样性的基因组，且速度更快。缺点是显然的，即该技术也与二代测序一样需要建库，并且这一技术误差率比较高，需要多次测序来分析和降低误差。

　　
　　

　　Oxford Nanopore技术即纳米孔技术，这一技术直接绕开了边合成边测序和荧光检测这两个传统思路。四种碱基由于有不同的结构，因此带电特点不同，通过纳米孔时引起的电流变化不同。通过测量电流变化来观测到不同分子穿过纳米孔。而通过分析ATCG四种碱基的特点，即可绘制测序结果图。其本质是检测变化的电信号。纳米孔的成分可以是生物纳米孔，即使用蛋白质镶嵌在膜上（Oxford Nanopore Technologies技术使用溶血素蛋白），也可以是化学纳米孔，如石墨烯，高分子材料孔。这一技术的优点非常明显，即理论上无读长限制，不需要额外碱基，可以直接测定RNA，再也不用逆转录（都是检测电信号），样品用量极少。然而目前这一技术发展瓶颈在于由于长DNA可能在孔口出现缠绕，且过孔控制不好，因此导至误差比较大。

　　
　　
　　四、总结
　　
　　我们最后来梳理一下三代技术的对比。一代技术，误差低，读长中等，但是速度慢，效率低。二代技术读长短，但是可以同步进行多个片段测序，效率非常高。三代测序读长超长，效率更高，且需要样品量极少（单分子），但在目前发展阶段，误差比较高。第三代测序技术的发展势头是不可阻挡的，随着新材料、新技术、新检测方法以及相关算法的进一步融合，第三代技术的误差将大幅下降。这时，三代测序相比于前两代技术的优势将变得非常明显，进而推动三代测序的实际应用。