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让你一文读懂三代测序技术

来源:思宇医械观察2019-09-30 11:07:55浏览:764
  一、一代测序
  
  一代测序又称Sanger测序,Frederick Sanger教授发展了这个方法,并依靠这一重要成果第二次获得诺贝尔奖。(Sanger是史上唯一获得两次诺贝尔化学奖的人,第一次获奖是因为针对蛋白质的研究)。Sanger测序依赖于一类特殊的核苷酸,即ddNTP(双脱氧核苷三磷酸);这种核苷酸不能形成磷酸二酯键,故会中断DNA的延长。
  

  如果用同位素对ATCG四个碱基进行部分标记,电泳后通过放射显影就可以知道这4个碱基出现的位置。例如针对序列ATCGATCGATCG,对A作为终止标记。即可得到三类片段,即A,ATCGA,ATCGATCGA。因此分析可以知道碱基A出现在第1位,第5位和第9位。同样,如果用同样的方法对其他碱基进行标记,也可以测定其余碱基的位置,最终获得待测序列的碱基顺序。

  
  图1. 终止,电泳和显影
  
  这一类测序方法操作简单,因此误差很小。但是缺点也显而易见,就是成本高,通量低,一次只能测一条DNA,而且测序长度有限制。测序极限长度就是能够完整无误的合成出的DNA长度,约为1000bp,对于更长的DNA以及更为复杂的情景,一代测序就无能为力了。因此,为了克服一代测序的局限,二代测序应运而生。
  
  二、二代测序
  

  二代测序的开发主要是为了解决一代测序长度限制,且通量低效率低的问题。目前,二代测序仪是市场主流,Illumina的测序仪成为了市场霸主。其基本思路就是将长的DNA(或者RNA反转录的cDNA)进行碎片化,之后利用接头将片段化的DNA固定在不同材质的表面。之后进行桥式PCR形成簇状结构,该过程扩增了DNA,相当于放大了信号强度。之后使用不同荧光基团对4种碱基进行标记,就可以根据荧光信号确认新合成的DNA单链时连接上去的碱基。

  
  图2. 桥式PCR原理
  
  这种测序方法可以做到边合成边测序,与传统第一代测序合成完进行电泳,显影最后得到结果相比,测序效率大大提高。且通过将长DNA片段化后,可以同时进行多个通道的测序,提高通量,减少时间。
  

  然而二代测序的缺陷也是显而易见的,即每一片段的读长比较短,大约只有500bp。进行长DNA测序时,需要对结果进行拼接,同样在边合成边测序的策略下,误差来源就是合成时碱基突变(GC突变等)。这就导至对于高度杂合的基因组、高度重复序列、高GC的区域、拷贝数变异等测序,二代测序有非常大的困难。而目前的生命科学研究中,这些问题又非常重要。

  
  图3. 回文序列与DNA发夹结构
  
  例如高度重复序列,在基因组中含量超过10%,最初的研究没有理解这些重复片段的意义。经过后续研究发现,这些重复序列与酶的结合,DNA、RNA发夹结构的形成,种属特异性等有直接关系,进而在生理病理过程中发挥非常重要的作用,而这些重复序列的数量和位置,往往不能利用二代测序准确获得。
  
  三、三代测序
  
  普遍认为三代测序就是单分子测序,即理论上可以进行超长读长,不需要进行PCR扩增的测序。以SMRT(Pacific Biosciences)技术和Oxford Nanopore为代表。
  

  其中SMRT技术还是采用了边合成边测序的思路,以及荧光检测的基本技术。SMRT中,碱基采用4种可断裂的荧光标记基团,当被DNA聚合酶合成到新生成的DNA链上时,荧光基团发生脱落,检测不同荧光脱落信号,即可获得序列。然而这一操作很容易被背景杂光干扰,因此该技术中还有一个重要组成部分就是零模波导孔,这是一个足够小的小孔(10nm),小到只能插入一个DNA聚合酶和一条DNA序列,因此在检测的时候可以不受到背景干扰,只探测到一条DNA的信号。这一技术读长可以达到10kbp,且需要样品量极少,非常利于长片段和高度多样性的基因组,且速度更快。缺点是显然的,即该技术也与二代测序一样需要建库,并且这一技术误差率比较高,需要多次测序来分析和降低误差。

  
  图4. 孔底部只有一个酶分子和一条DNA链
  

  Oxford Nanopore技术即纳米孔技术,这一技术直接绕开了边合成边测序和荧光检测这两个传统思路。四种碱基由于有不同的结构,因此带电特点不同,通过纳米孔时引起的电流变化不同。通过测量电流变化来观测到不同分子穿过纳米孔。而通过分析ATCG四种碱基的特点,即可绘制测序结果图。其本质是检测变化的电信号。纳米孔的成分可以是生物纳米孔,即使用蛋白质镶嵌在膜上(Oxford Nanopore Technologies技术使用溶血素蛋白),也可以是化学纳米孔,如石墨烯,高分子材料孔。这一技术的优点非常明显,即理论上无读长限制,不需要额外碱基,可以直接测定RNA,再也不用逆转录(都是检测电信号),样品用量极少。然而目前这一技术发展瓶颈在于由于长DNA可能在孔口出现缠绕,且过孔控制不好,因此导至误差比较大。

  
  图5. 通过穿过孔的电信号变化获得碱基信息
  
  四、总结
  
  我们最后来梳理一下三代技术的对比。一代技术,误差低,读长中等,但是速度慢,效率低。二代技术读长短,但是可以同步进行多个片段测序,效率非常高。三代测序读长超长,效率更高,且需要样品量极少(单分子),但在目前发展阶段,误差比较高。第三代测序技术的发展势头是不可阻挡的,随着新材料、新技术、新检测方法以及相关算法的进一步融合,第三代技术的误差将大幅下降。这时,三代测序相比于前两代技术的优势将变得非常明显,进而推动三代测序的实际应用。

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