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微量检测

荧光计

概况

快速简单 - 可直接测量纯化样品，无需稀释

特异性测量dsDNA，ssDNA，总RNA、microRNA浓度

技术原理

光吸收

荧光

工作流程

1.将样品移液到基座上

2.测量

3.读取吸光度

1.将样品与试剂混合

2.孵化2-5分钟;

3.读取荧光值

应用

对DNA，RNA和蛋白质的浓度和纯度进行评估

当样品浓度极低（＜2ng/ul）或需要更高的灵敏度或怀疑核酸污染物时（例如RNA中含有的DNA或dNTPs）

dsDNA定量范围（ng /μl）

2-15,000

0.01–1000

核酸样品纯度评估

样品纯度简单评估

A260/A280

A260/A230

（图1）

无法对样品纯度进行评估

（图2）

微量检测

荧光计

提供预编程的一些应用

1.直接定量A280

2.缺乏色氨酸和酪氨酸残基的蛋白质或肽的A205肽键吸光度

3.比色蛋白质测定：Bradford、BCA、Lowry

1.荧光检测可显示出蛋白质与蛋白质之间微小的差异（BSA、鸡卵白蛋白、鸡蛋溶菌酶、IgG等均可区分）；

2.检测结果不会被大多数污染物干扰，包括盐类、还原剂（DTT，β-巯基乙醇）、DNA和氨基酸，但不能清除洗涤剂。

微量检测

荧光计

常规PCR

由于常规PCR已广泛应用，通常只需用微量检测来量化模板。

荧光计亦适用于常规样品，尤其是当样品中含有A260的污染物时（dNTPs，寡核苷酸，RNA等），其为优选。

定量PCR

微量检测可通过260/280、260/230等比值来判断核酸纯度，避免因样品问题导致的引起的扩增失败（例如苯酚等）。

荧光计可精确定量核酸浓度，但是由于缺少不能反应样品纯度，低纯度样品可能对PCR反应会存在抑制现象。

测序

通常可用微量来量化模板，除非样品在260nm处容易产生大量的污染物（例如DNA样品中的 RNA）。

如果样品在260nm处容易产生大量的污染物，则荧光计测定的高特异性是优选。

NGS

在库构建过程中，当允许不影响下游实验的污染物存在时，可用微量检测

可靠的NGS结果需要高度准确的模板浓度，荧光计的特异性和灵敏度更符合需求。

RT-qPCR

标准RNA提取不易受DNA污染，因此微量检测可用于确定下一步反应的RNA量。

荧光计检测的特异性和灵敏度适用于常规样品，当样品含有DNA污染或降解RNA（dNTP或NTP），则荧光计检测是优选。

二者直观的工作流程

1.选择

2.阅读样本

3.查看结果