如何选择合适的光源获得优质的荧光成像

　　荧光显微镜是利用特定波长的激发光照射被检物体产生荧光进行镜检的显微光学观测技术，已有100多年历史。在生物医学领域应用广泛，大多数实验室都有配备高端或者常规的显微成像系统，荧光显微镜用于研究细胞内物质的吸收、运输、化学物质的分布及定位等。 细胞中有些物质，如叶绿素等，受紫外线照射后可发荧光;另有一些物质本身虽不能发荧光，但如果用荧光染料或荧光抗体染色后，经紫外线照射亦可发荧光，荧光显微镜就是对这类物质进行定性和定量研究的工具之一。
　　
　　如何选择合适的光源以获得优质的荧光效果。
　　
　　一.荧光显微镜简要原理
　　
　　荧光显微镜的基本构造通常由普通光学显微镜再加一些如荧光光源 、激发滤片、双色束分离器及阻断滤片等附件的基础上组成。同时采用的荧光光源一般为超高压汞灯，它可发出各种波长的光，且每种荧光物质都会有一个产生最强荧光的激发光波长 ，这时需加置激发滤片，通常有紫外、紫色、蓝色及绿色激发滤片，仅需使一定波长的激发光透过并照射到标本上，并将其他光都吸收掉。
　　二．影响到荧光显微镜成像效果的因素
　　
　　影响荧光显微镜成像的荧光因素很多，主要包括：荧光样品的制备，荧光光源的选择，滤片转盘的设计，荧光滤片的组合策略（激发光滤片，发射光滤片，双色镜分光滤片，带宽选择），显微镜物镜种类，显微镜摄像系统的选择等问题。荧光的激发、滤光、成像、淬灭，荧光实验的调整就是怎么才能协调好以上因素得到最好的效果，其中影响到成像效果的一个重要因素即是荧光光源。
　　三．荧光显微镜光源种类及介绍
　　
　　荧光显微镜的常用光源通常都是白光光源：高压汞灯，氙灯，金属卤素灯和LED白光光源以及高端的LED单波长光源。
　　
　　1、汞灯
　　
　　超高压汞灯（50-200W），它是用石英玻璃制作，中间呈球形，内充一定数量的汞，工作时由两个电极间放电，引起汞蒸发，球内气压迅速升高，当汞完全蒸发时，可达50～70个标准大气压力，这一过程一般约需5～15min。超高压汞灯的发光是电极间放电使汞分子不断解离和还原过程中发射光量子的结果。它发射很强的紫外和蓝紫光，足以激发各类荧光物质，因此，为荧光显微镜普遍采用。推荐产品：欧司朗50W，103W，200W汞灯，适用于各大厂家高端荧光显微镜；一般200小时寿命。
　　
　　2、氙灯
　　
　　氙灯和汞灯做为白光源，都能提供从紫外到近红外一系列波长的光，但它们却有着不同的激发光谱。汞灯集中在近紫外、蓝光以及绿光附近，这种在峰值的高激发能量确保产生明亮的荧光信号，但光毒性却很强。因此，HBO用来对固定样品或弱荧光成像。相比而言，氙灯光源的激发比较平缓，可以用于不同波长间强度的比较，例如用于钙离子浓度测量等。氙灯的强激发在近红外800-1000nm。
　　
　　XBO较HBO的特点：
　　
　　1）光谱强度更均匀
　　
　　2）在红外及中红外仍有较强光谱强度
　　
　　3）能量较强更易到达物镜后孔径
　　
　　此类产品：XBO75W，100W氙灯；寿命一般400小时，1200小时
　　
　　3、金属卤素灯
　　
　　目前各大显微镜品牌广泛使用的一种光源，它和汞灯的激发光谱很像，但它和显微镜以光纤相连，能散热，寿命更长。光纤从光源连到显微镜上，可以大量减少光产生的热能。金属卤素灯对活细胞成像的另一个优势是内置强度设计装置，可以容易调节激发光。也可以通过选择直接连接获得更好的激发效果。