流式细胞仪的原理和构造

　　流式细胞仪的原理和构造
　　

　　流式细胞仪主要由四部分组成；流动室和液流系统；激光源和光学系统；光电管和检测系统；计算机和分析系统，其中流动室和液流系统是仪器的核心部件。

　　
　　1.流动室和液流系统：流动室由样品管、鞘液管和喷嘴等组成，常用光学玻璃、石英等透明、稳定的材料，其设计和制作均很精细，是液流系统的心脏。
　　
　　2.激光器和光学系统：光源主要根据被激发物质的激发光谱而定，常用的光源有激光器和弧光灯。激光器以氩离子激光器最为普遍，也配有氪离子激光器或染料激光器。氩离子激光器的发射光谱中，绿光 514 nm和蓝光 488 nm的谱线最强，约占总光强的 80% ；氪离子激光器光谱多集中在可见光部分，以 647 nm较强；免疫学上使用的一些荧光染料激发光波长在 550 nm以上，可使用染料激光器。汞灯是最常用的弧光灯，其发射光谱大部分集中于 300-400 nm，适合需要用紫外光激发的场合。
　　
　　3.光电管和检测系统：经荧光染色的细胞受合适的光激发后所产生的荧光是通过光电转换器转变成电信号而进行测量的。光电倍增管（ PMT ）最为常用。
　　
　　4.计算机和分析系统：经放大后的电信号被送往计算机分析器。
　　
　　流式细胞检测的临床应用
　　
　　1.免疫学领域：淋巴细胞亚群检测，用以评估机体的免疫状态、辅助疾病如 AIDS/HIV 的诊断等，是目前各医疗单位开展和应用最广泛的项目。
　　
　　2.血液学领域：血液系统疾病的免疫分型及白血病微小残留病变( minimal residual disease，MRD )监测，用于血液系统疾病的诊断、治疗评估和复发监测。FCM 的细胞免疫分型是国际公认的诊断造血细胞疾病必不可少的重要标准之一，是目前被广泛接受和认可的免疫分型方法。
　　
　　3.临床肿瘤学：主要是 DNA 倍体和细胞周期分析，了解细胞 DNA 倍体和增殖能力，异常倍体的出现意味着 DNA 合成的异常，可能是肿瘤或是癌前病变发生的重要标志。另外，FACS 还可以检测分析肿瘤相关标志物（肿瘤细胞的增殖活性标志分子、分化标志分子、凋亡标志分子以及免疫学标志物），用于肿瘤发病机制的研究、个性化治疗方案的制定以及预后判断等。
　　
　　4.临床细胞治疗：流式细胞仪是在细胞治疗领域的一个重要的研究和研发依托，其特有的单细胞水平分析能力在细胞治疗领域中发挥不可或缺的作用。
　　
　　5.临床微生物：FACS 快速、灵敏以及可以同时进行多参数分析的优点，使其在临床微生物检测中的作用受到越来越多的关注。不仅可以检测病原菌、毒素和血清抗体，还可用于抗生素敏感性试验，对抗生素后效应、细菌耐药的异质性等进行分析。
　　
　　6.外周血细胞分析：五分类血细胞分析仪（将白细胞分成 5 个类别）是临床检验应用最为广泛的血细胞分析仪。
　　
　　7.尿沉渣分析：目前，一些全自动尿沉渣分析仪也应用了 FCM ，例如 SYSMEXUF 系列尿沉渣分析仪就是采用 FCM 结合荧光染色和半导体激光技术，将检测通道分为沉渣通道和细菌通道。
　　
　　8.辅助生殖：流式细胞术在辅助生殖医学领域得到了大量应用,在判断免疫性不孕、预测精子受精能力等技术中发挥重要作用。
　　
　　流式细胞检测的发展趋势
　　
　　流式检测技术的发展方向无非两端，一端「仰望星空」向着更高、更快、更强不断进行性能优化，另一端「脚踩大地」进行尽可能的 POC 化。
　　
　　1.应用对象从细胞到颗粒
　　
　　流式细胞仪可以将「颗粒」视同为「细胞」来进行检测，在特制的微球上包被抗原，抗体或核酸探针，以微球为载体来检测各种可溶性蛋白、细胞因子、自身抗体、特定的核酸序列等，从而使流式细胞仪的检测对象扩展到分子范围。
　　
　　2.从相对计数到绝对计数
　　
　　传统流式细胞仪测试结果为相对计数，即目标细胞在某一总体系中的比值。随着应用的深入，绝对计数被证明更具实际价值。目前主要采用计数微球和测定进样体积来实现。
　　
　　3.流路、光路、数据分析的优化
　　
　　速度的提升是光路，流路和数据采集系统三者共同优化改善的结果。
　　
　　√ 流路：Guava 平台 easyCyte 通过负压进样，其优点是无需鞘液，产生废液也少；Thermo 公司声波流式细胞仪 Attune NxT 利用超声波将细胞聚集在样品流中轴线上，大大加快了进样速度；
　　
　　√ 光路：庞大的水冷或气冷的激光器逐渐被小型化的固态激光器取代、光纤传导应用越来越普遍、雪崩光电二极管等等新检测器提供新的选择；
　　
　　√ 数据分析：随着数字化技术的引入以及数据处理系统的升级，流式细胞仪的数据处理能力得到极大提升。
　　
　　4.从传统流式到质谱流式 & 光谱流式
　　
　　传统流式存在光谱渗漏、自发荧光等问题，使用的荧光染料的数量越多，这些问题就越大，为了克服这些问题，出现了质谱流式和光谱流式。
　　
　　√ 质谱流式：与传统流式相比，其标签系统（金属元素）和检测系统（ ICP 质谱技术）不同，最大的特点是超高分辨率，通道数量大大提升、无需计算荧光补偿、没有自发荧光（因为细胞内部不含镧系元素离子）等等；
　　
　　√ 光谱流式：光谱流式是从另一条路解决荧光补偿问题，即光谱解析。不同荧光素都有其独特的光谱特征，通过事先学习荧光素的光谱特征，就智能消除传统流式的荧光渗漏影响。
　　
　　5.从「高大上」到「矮穷矬」
　　
　　√ 小型化（矮）：「小」意味着节省空间，容易安装和转移，「小」更值得期许的是减少样本体积，降低试剂消耗，提高检测速度，以及缩小空间所带来的光电及液路的改善。
　　
　　√ 便宜（穷）：国外进口的流式细胞仪多数价格较高（超过 50 万元），对于价格较为敏感的三级以下医院采购门槛太高；
　　
　　√ 自动化（矬人也会操作？）：传统流式操作复杂，人员培训周期长，通过各流程优化，实现全流程的自动化操作，将大大降低流式的临床应用门槛。
　　
　　国外流式检测主要企业
　　
　　1. 美国 BD ：流式细胞检测领域的龙头企业，占据超过 40% 的全球市场份额，拥有包括分析型流式、分选型流式、流式液相芯片等，产品齐全。其多个流式试剂产品获 CFDA 注册批准。
　　
　　2. 贝克曼（&赛景生物）：贝克曼同样为流式细胞领域的巨头，并于 2014 年收购苏州塞景（估值 1 亿美元）。其主要产品包括 Navios 流式细胞分析仪、 Gallios 流式细胞分析仪 、DxFLEX 流式细胞仪（已获 CFDA 批准）、CytoFLEX S 流式细胞仪。根据国内仪器信息网的统计，2018 年贝克曼库尔特 CytoFLEX 在单品销售中国销量荣登榜首，占比 7.7%；
　　
　　3. 安捷伦（艾森）：2018 年 9 月，以 2.5 亿美元的现金收购国产流式细胞仪制造商——艾森生物( ACEA )，主要产品包括 xCELLigence 和 NovoCyte ；
　　
　　4. 赛默飞：赛默飞世尔科技的 Attune NxT 流式细胞仪是市面上唯一一款具有声波聚焦专利技术的流式细胞仪，其液流系统采用独有的声波辅助流体动力学双重聚焦，上样速度是传统流式细胞仪的 10 倍。
　　
　　5. Luminex ：美国纳斯达克上市公司，拥有 XAMP（Multi-Analyte Profiling）液相芯片技术，可一次检测完成多项蛋白、核酸指标检测。
　　
　　6. DVS Sciences：DVS Sciences 公司的总部位于美国加州森尼韦尔，于 2014 年被 Fluidigm 以 2 亿美元收购，主要生产 CyTOF 2 仪器和 MaxPar 试剂。其中 CyTOF 2 是结合质谱和流式细胞术的新型高通量细胞分析方法。
　　
　　7.索尼：索尼作为一家光电科技领域的先驱者，成功缔造了全球首款全光谱流式细胞仪，舍弃仅能检测狭窄范围信号的传统滤光片，首次采用棱镜模组分光和专利技术 32 联排 PMT，实现 420-800 nm 波长范围内光谱荧光信号检测。
　　
　　国内流式检测主要企业
　　
　　1.迈瑞医疗：BriCyte E6 于 2014 年获得医疗器械注册证，具有双激光四色、双激光五色和双激光六色等配置，可实现淋巴细胞亚群四色分析和 HLA-B27 双色分析的自动化操作，同时配套使用的多款流式试剂也取得了医疗器械注册证；
　　
　　2.中生北控：2016 年 8 月，中科院苏州医工所承担的国家 863 计划重大项目「医用新型流式细胞仪研制」获得了国家验收，中生（苏州）医疗科技有限公司以 1500 万元获得了该技术的转让，2018 年 5 月，其小型全自动 ZS-AE7S 流式细胞仪取得医疗器械产品注册证。
　　
　　3.指真生物：2019 年 9 月，指真生物 CytoPOC 系列流式细胞仪获得北京市药品监督管理局批准的二类医疗器械注册证。指真生物 CytoPOC 系列流式细胞仪与 PreSampler 样本处理器组合产品，是针对基层医疗机构「流式检验人员不足、样本量少、操作需求简易化」等实际「痛点」开发的智能化、自动化流式产品；
　　
　　4.赛雷纳（中国）：2019 年 2 月，赛雷纳（中国）医疗科技有限公司自主研发的新一代小型流式细胞仪获得国家食品药品监督管理局（ CFDA ）批准的二类医疗器械注册证，成为国内获批上市的首个自主品牌的小型流式细胞仪产品，相关配套试剂也同期获取 CFDA 批准上市证书。
　　
　　5.唯公科技：一家专门从事流式细胞仪、液相芯片仪、液相芯片编码微球等体外诊断医疗设备和试剂研发的公司。唯公科技研发的 EasyCell 系列流式细胞仪配置为 1~2 激光 2-6 色，主要定位于科研和医疗市场的中、低端客户，预计 2019 年获证上市。
　　
　　6.博奥生物：博奥集团于 2015 年由其北京研发中心开发了 Cytonova 流式细胞仪，配置为 1~2 激光 3-6 色，并由子公司成都博奥新景医学科技有限公司在 2016 年获得 CFDA 注册证（据传由于公司战略调整，导致转产不顺利，至今市场上仍未见到这款产品）。
　　
　　7.必达科生物：常州必达科生物科技有限公司专注于中高端流式细胞仪及试剂的研发、生产和销售，其自主研发的第一代产品BeamCyte系列流式细胞仪近期获国家食品药品监督管理局批准，取得二类医疗器械注册证；同时，必达科即将推出满足更高应用需求的第二代全自动、高通量高配机型。
　　
　　8.厦泰生物：2019 年 9 月，上海厦泰生物科技有限公司的全光谱流式细胞仪（ Northern Lights-CLC ，以下简称 NL-CLC ）获得上海药品监督管理局II类医疗器械注册证的批准，成为国内首个获批可用于临床检测的光谱流式细胞仪。
　　
　　9.宸安生物：2019 年 9 月，宸安生物对外宣布完成 A+ 轮融资,融资所得将用于继续推进以质谱流式技术为核心的单细胞高通量多组学诊断平台的技术研发和转化应用。
　　
　　10.竞天生物：广州竞天生物科技有限公司由广州呼吸疾病研究所联合国内上市公司投资成立，公司主要产品是 PanaCyte 流式细胞仪。
　　
　　11.透景生命：2017 年已于创业板上市，其技术依托 Luminex 技术平台，主要开发液相芯片相关肿瘤标记物试剂。
　　
　　12.旷博生物：国内流式试剂行业领头企业，利用 AimPlex 技术提供液相芯片试剂，同时通过收购的同生时代提供其他流式试剂产品。截止至 2018 年上半年，公司共获得 52 个流式产品医疗器械证书，其中 16 个三类，36 个一类。
　　
　　13.赛基生物：流式细胞检测试剂生产企业，通过检测T细胞亚群以及相关细胞因子，来评估机体免疫状态；在流式免疫分析的细胞因子细分领域，赛基生物的市场占有率达 90% 以上。
　　
　　14.益善生物：三项自主研发的 KRAS 、Braf 、PIK3CA 等三项基因突变检测试剂盒（流式荧光杂交法）获得国家食品药品监督管理局颁发的《医疗器械注册证》。
　　
　　总结
　　
　　1. 从市场角度来说，科研市场相对开始饱和，除仪器的换代升级以外，主要增长点会是小型化个人化机器从平台进入独立实验室；临床市场目前处于快速发展期，并且由于试剂的准入门槛降低，流式细胞仪会更快的普及；
　　
　　2. 从技术角度来说，目前激光数量与通道数量的发展基本满足了大多数实验的需求，发展方向还是以性能与易用性为主。包括液相芯片、光谱流式、质谱流式、液流、光流和计算能力的提升、仪器自动化、前处理自动化等等；
　　
　　3. 从应用方向来看主要还是以免疫、肿瘤、单细胞研究为主。特殊的一些方向例如单细胞分选、微小颗粒的分析分选将会是未来的热点；
　　
　　4. 从企业角度来说，发现一些新的应用领域（比如透景推出的肿瘤、自免疾病的多指标联检）、快速 follow 国外的先进技术（比如夏泰生物的光谱流式、宸安生物的质谱流式）或跟随国内分级诊疗的推进实现流式的 POC 化（比如成都赛雷诺和北京指真生物），都是不错的策略。
　　
　　文章来源：智银医药