蛋白浓度测定常见的四种方法

　　No.1蛋白质定量分析
　　
　　蛋白质的定量分析是生物化学和其他生命学科最常涉及的分析内容，是临床上诊断疾病及检查康复情况的重要指标，也是许多生物制品，药物、食品质量检测的重要指标。在生化实验中，对样品中的蛋白质进行准确可靠的定量分析，则是经常进行的一项非常重要的工作。
　　
　　蛋白质种类很多，结构不均一，分子量又相差很大，这样就给建立一个理想而又通用的蛋白质定量分析的方法带来了许多具体的困难。目前测定蛋白质含量的方法有很多种，根据测量方法不同可分为下列几种。
　　
　　◆ 物理：紫外分光光度法
　　
　　◆ 化学：凯氏定氮法、Folin-酚试剂法（Lowry法）、BCA法
　　
　　◆ 染色或荧光：考马斯亮蓝法（Bradford法）、银染法、荧光染料
　　
　　No.2常见四种方法
　　
　　蛋白浓度测定的方法有很多，但每种方法都有其特点和局限性，因而需要在了解各种方法的基础上根据不同情况选用恰当的方法，以满足不同的要求。例如凯氏定氮法结果最精确，但操作复杂，用于大批量样品的测试则不太合适；Lowry法精确度较高，但是比较费时，且每步的时间要求相对严格；Bradford法灵敏简便，但易受去垢剂的影响；BCA法以其试剂稳定，抗干扰能力强，结果稳定，灵敏度高而受欢迎。
　　

　　在蛋白浓度测定中，以下面四种方法最为常见：

　　
　　下面主要对lowry法，braford法，BCA法，紫外分光光度法，这几种常用方法进行介绍：
　　
　　一：lowry法
　　
　　其原理是蛋白中含有酚基的络氨酸，可与酚试剂中的磷钼钨酸作用产生蓝色化合物，其最大吸收波长为750nm，蛋白含量与750nm的吸光度成正比。
　　
　　该方法的特点是灵敏度高，反应约在15分钟有最大显色，并最少可稳定几个小时，不足之处是实验过程中需精准控制试剂加入时间，干扰因素较多（如上表）。
　　
　　二：BCA法
　　
　　碱性条件下，Cu2+被蛋白还原成Cu+，与BCA试剂形成蓝紫色的络合物，在562nm处具有最大吸收峰，在一定范围内，蛋白含量与562nm的吸光度成正比。
　　
　　该方法灵敏度高，操作简单，试剂及其形成的颜色复合物稳定，受干扰物影响较少，其优点是不受去垢剂的影响，可兼容样品中高达5%的SDS，5%的TritonX-100，5%的Tween20，60，80。但会受螯合剂和略高浓度的还原剂的影响。
　　
　　三：Bradford法
　　
　　考马斯亮蓝G250,在游离状态下呈红色，最大光吸收在488nm；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质—色素结合物在595nm波长下有最大光吸收。在一定范围内，其光吸收值与蛋白质含量成正比。
　　
　　Bradford法灵敏度高，可检测到微量蛋白，操作简便、快速，重复性好，但常用的试剂会对结果有不同程度的干扰，其中Tris、巯基乙醇、蔗糖、甘油、EDTA及少量去垢剂有较小影响，而1%SDS、1%TritonX-100及1%Hemosol的干扰严重。且显色结果受时间和温度的影响较大，须注意保证样品与标准的测定控制在同一条件下进行。
　　
　　四：分光光度计法
　　
　　受蛋白质中络氨酸、色氨酸残基影响，蛋白质溶液在280nm附近有强烈的吸收。若蛋白溶液中杂有的核酸，对测定结果会有较大影响，而核酸最大吸收峰在260nm。所以同时测定280nm及260nm两种波长的吸光度，通过计算可得较为正确的蛋白含量。
　　

　　该方法测定不需要任何试剂，操作简单，且样品可回收。但在使用公式计算时也应该注意各种蛋白和各种核酸在280nm及260nm处的吸光值也不尽相同，故计算结果有误差。

　　Nano-500是一款有荧光检测功能，无须配备电脑的全波长（200-800nm）超微量分光光度计。每次测量所需要的样本量仅需0.5ul至2ul，就可快速准确的检测核酸、蛋白质和细胞溶液，同时配备比色皿模式，进行细菌等培养液浓度的检测，新增的荧光检测，搭配荧光定量分析试剂盒，通过荧光染料与目标物质的特异性结合科精确定量DNA、RNA和蛋白质浓度，且最低限可达到0.5pg/ul(dsDNA）。
　　
　　定制的安卓系统，7寸电容触摸屏，无需电脑联机，单机即可检测
　　
　　长寿命脉冲氙灯光源，智能识别用户使用情况，5分钟内无操作，将自动关闭光源，以延长使用寿命
　　
　　主要用来检测核酸浓度和纯度，在260nm处检测核酸的浓度，使用260/280比率可以测量核酸纯度
　　
　　在280nm处检测蛋白质浓度
　　
　　Nano-500新增荧光检测功能，可以兼容常见的商业化荧光定量试剂，为用户提供最大的使用便利及最低的检测成本
　　
　　极快的检测速度，无需预热，可随时检测。每个样品的测量在很短的时间内测试完成
　　
　　更长的光学组件寿命，智能识别用户使用情况，5分钟内无操作，将自动关闭光源，以延长使用寿命
　　
　　样品无需稀释，可测样品的浓度范围是常规紫外-可见光光度计的50倍
　　
　　简单易用的数据至打印机选项，您可通过内置打印机直接打印报告

型号		Nano-500
波长范围		波长200-800nm
样本体积要求		0.5-2ul
光程		0.2mm、0.05mm（高浓度测量）1.0mm（普通浓度测量）
光源		氙闪灯
检测器		2048单元线性CCD阵列
吸光度精确度		0.005Abs（0.2mm光程）
吸光度准确度		±1%（7.332Abs at 260nm)
吸光率范围(等效于10mm)		0.04 - 200A
核酸检测范围		2-12000ng/μl（dsDNA）
检测时间		<6S
数据输出方式		USB
样品基座材质		石英光纤和高硬质铝
OD600	吸光度范围	0~4.000 Abs
	吸光度稳定性	[0,3）≤0.5%, [3,4）≤2%
	吸光度重复性	0,3）≤0.5%, [3,4）≤2%
	吸光度准确性	[0,2）≤0.005A,[2,3）≤1%,[3,4）≤2%
电源适配器		24V DC
功耗		25W
待机时功耗		5W
尺寸（W×D×H）mm		208*310*186
重量		3.6kg
软件操作平台		安卓系统