ELISA实验中出现的现象解析

　　ELISA实验因灵敏度高，特异性强在生物科研上得到了广泛的认可，但对初学者而言，如不注意实验操作过程中的各个环节，可能会对最终的实验结果产生比较大的影响，比如实验出现白板，显色弱灵敏度低，花板无梯度背景高等现象。下面对以上实验现象进行一一解析。
　　
　　一、白板现象
　　
　　在完成所有实验步骤进行底物TMB溶液显色后，酶标板中所有孔的颜色均为无色，即无信号呈现。
　　
　　出现该现象的可能原因：
　　
　　1.试剂已过保质期，不同批次稀释液交叉使用。
　　
　　2.错加漏加检测A，检测B或者底物溶液TMB。
　　
　　3.洗板或者加样过程中，酶标记物被污染失活，稀释液中含有酶抑制剂如叠氮呐等。
　　
　　4.配置稀释液的蒸馏水可能被污染。
　　
　　5.洗涤液是浓缩型的，没有按比例进行稀释。
　　
　　6.酶标记物的活性和效价比较低。
　　
　　7.溶液的PH值不正确，一般稀释液的PH值应保持在7.2-7.4。
　　
　　二、显色弱灵敏度低
　　
　　在完成所有实验步骤进行底物TMB溶液显色后，酶标板中孔的显色比较浅，即只有微弱的信号呈现。
　　
　　出现该现象的可能原因：
　　
　　1.产品过有效期，试剂没有按规定进行适当的保存。
　　
　　2.试剂，标准品或者样品在使用前没有平衡到室温。
　　
　　3.少加了试剂的量或者加入试剂的稀释比例不当。
　　
　　4.洗板或者加样过程中，酶标物受污染失活。
　　
　　5.孵育时间和孵育温度未达到实验要求。
　　
　　6.洗涤液稀释倍数不符合要求，洗板次数过多，洗板冲击力过大，洗板浸泡时间过长。
　　
　　7.底物溶液TMB显色时间太短。
　　
　　三、花板无梯度背景高
　　
　　在完成所有实验步骤进行底物TMB溶液显色后，酶标板中的孔有颜色但没有梯度，背景也可能较高
　　
　　1.底物溶液TMB未置于阴凉避光处保存，实验前溶液已经变蓝。
　　
　　2.孵育温度过高或者孵育时间过长，发生了较强的非特异性吸附。
　　
　　3.没有按说明书要求洗板，特别是洗板时洗涤液的量少加了。
　　
　　4.加样时没有换枪头造成交叉污染。
　　
　　5.花板现象：低浓度或者低活性的包被抗体或者检测抗体，封闭不足导致的本底不稳定，洗板不充分，包被板子的问题。
　　
　　综上所述：在ELISA实验中应注意以下问题：
　　
　　1.在实验前应该按相关要求将实验试剂平衡至室温。
　　
　　2.包被抗体和检测抗体应该是有高活性的且都针对同一抗原。
　　
　　3.试剂保存：蛋白抗体类试剂保存于-20摄氏度，显色液洗涤液保存于2-8摄氏度。
　　
　　4.各试剂在使用前应充分混匀，以保证试剂的均一性和准确性。
　　
　　5.严格控制反应温度和反应试剂。
　　
　　6.洗板次数，洗板液的量，洗板液浸泡时间的长短，洗板的力度都是应该注意的问题。
　　
　　7.相关浓缩液应按要求稀释到相应比例方可使用，PH值要保持在7.2-7.4之间。
　　
　　8.在终止反应时尽量避免微孔中存有气泡。
　　
　　9.终止反应完成后应该在2min内完成酶标仪读数。