实时荧光定量PCR技术

实时荧光定量PCR (real time fluorogenetic quantitative PCR, FQ-PCR)，是在PCR定性技术基础上发展起来的核酸定量技术。它是一种在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时检测整个PCR过程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。该技术不仅实现了对DNA模板的定量，而且具有灵敏度高、特异性和可靠性更强、能实现多重反应、自动化程度高、无污染性、具实时性和准确性等特点，目前已广泛应用于分子生物学研究和医学研究等领域。

在荧光定量PCR技术中，有一个很重要的概念是Ct值。C代表Cycle, t代表threshold, Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。

研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可做出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表Ct值。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。

荧光定量PCR所使用的荧光物质可分为2种：荧光染料和荧光探针。荧光染料法是指SYBR Green I法，荧光探针法包括Taqman探针法、LightCycler法和分子信标（Molecularbeacon）法。

SYBR Green I法是在PCR反应体系中加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。扩增产物序列特异性通过反应后变性分析来确证。在反应的最后阶段，反应体系的温度逐渐升高，双链DNA慢慢地变成单链，从而SYBR Green I染料释放出来，导致荧光强度的慢慢降低，测定整个过程的荧光强度，可以获得PCR产物的变性温度，因为每一种PCR产物都有不同的长度和GC百分比，所以也具有特征性的变性温度。通过变性曲线得到的产物大小可以和PCR产物的电泳结果相比较。这种方法在检测禽肉中的沙门氏菌和干冻食品中的细菌活性方面已有报道。

Taqman探针法是利用Taq DNA聚合酶的5'→3'核酸酶活性来酶切和降解标记报告荧光基团和淬灭荧光基团的探针，所以称为Taqman探针。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，PCR扩增时，Taq酶的5'→3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。PCR扩增产物的指数增加和荧光强度的增加是相对应的。这个系统现在已经商品化，TagMan系统已经被用来检测食物或者纯培养物中的单核增生李斯特氏菌、大肠埃希氏菌0157: H7和沙门氏菌。

分子信标探针是一种具有茎和环状结构的单链核酸分子，探针分子中环状部分的序列和靶核酸的主要已知序列互补，茎部是通过探针序列任何一侧的2个互补臂序列退火形成。臂序列和靶序列没有关系，一个荧光基团贴附在一个臂的终端，一个非荧光基团贴附在另一个臂的终端。茎部使得这2个基团紧紧地贴在一起。从而使得荧光团释放出来的荧光被FRET淬灭。荧光团一淬灭对的原理是荧光团接收到的荧光转移到淬灭物上，消散为热而不是光，结果荧光团不能释放荧光。但是当探针遇到靶分子时，形成的杂交物比通过臂序列形成的杂交物长并且稳定，因为核酸的二级螺旋结构相对坚硬，探针和靶序列的杂交就排除了同时存在臂序列杂交的可能。这样，探针就经过自然结构的改变而使臂序列分开，进而使荧光团和淬灭物相互分离。因为荧光团和淬灭物不再紧密地连接在一起，所以在紫外线灯照射下能够产生荧光。这种方法对致病性反转录病毒的检测、沙门氏菌和大肠埃希氏菌0157的检测都有应用。

核酸杂交法

核酸杂交技术是分子生物学领域中最常用的基本技术方法之一。其基本原理是：具有一定同源性的两条核酸单链在一定条件下（适宜的温度及离子强度等）可以按碱基互补原则退火形成双链。此杂交过程是高度特异性的。杂交的双方分别是待测核酸序列及探针。用于检测的已知核酸片段称之为探针（probe)。为了便于示踪，探针必须用一定的手段加以标记，以便于随后的检测。常用的标记物是放射性核素、地高辛半抗原（digaoxigenin)，生物素(biotin)，辣根过氧化物酶(HRP)，还可以标记一些荧光物质如异硫氰酸荧光素（FITC),花青（cyanine, Cy2, Cy3, Cy5）等。

核酸杂交中经常使用的是印迹杂交技术。印迹杂交技术是指将带检测的核酸分子结合到一定的固相支持物上，然后与存在于液相中标记的核酸探针进行杂交的过程。其操作基本流程是：首先用凝胶电泳将待测核酸片段分离，然后用印迹技术将分离的核酸片段转移到特异的固相支持物上，转移后的核酸片段将保持其原来的相对位置不变。再用标记的核酸探针与固相支持物上的核酸片段进行杂交。最后洗去未杂交的游离探针分子，通过放射自显影等检测方法显示标记的探针的位置。由于探针已与待测核酸片段中的同源序列形成杂交分子，探针分子显示的位置及其量的多少，则反映出待测核酸分子中是否存在相应的基因序列及其量与大小。

用于核酸杂交的固相支持物的种类很多。常用的主要有硝酸纤维素膜（nitrocellulose) ,尼龙膜（nylon membrane)、化学活化膜（chemical activated paper）等。印迹的方法也有多种：可以直接将核酸样品点样于固相支持物上，称为斑点或狭缝印迹法；利用毛细管虹吸作用有转移缓冲液带动核酸分子转移到固相支持物上；利用电场作用的电转法；利用真空抽滤作用的真空转移法。

在微生物诊断和鉴别方面一个重要的发展就是核酸探针的引进。它可以解决使用抗体检测微生物时存在的非特异性问题。核酸杂交方法的一个主要不利方面，是需要相对大量的样本量（典型的104-105细菌）才能获得明确的结果，因为样品中同时含有大量的非特定微生物会干扰杂交结果，所以，在食品微生物方面主要是利用琼脂平板上的细菌进行菌落原位印迹杂交。